本发明涉及痕量污染物分析领域，具体涉及一种采用含锆卟啉有机骨架材料(pcn-224)为固相萃取吸附剂进行富集、采用液相色谱-串联质谱对食品及水体中痕量磺胺类抗生素进行分析的方法。
背景技术
磺胺类抗生素是一类化学合成的并且具有苯磺酰胺结构的抗菌物质，这种抗生素具有较宽的抗菌谱，价格低廉，疗效确定，并且方便安全。因此，它是中国、欧盟以及许多发展中国家使用最广泛的合成兽药抗菌剂。但是这类化合物能通过生物代谢进入食物链，并且摄入的磺胺药物量要远大于被代谢的药量，易在生物体内造成累积。抗生素残留，特别是磺胺类药物，会对肝脏和肾脏造成损害。检测食品和饮用水中的磺胺类药物残留对于公共健康事业具有重要意义。液相色谱-串联质谱技术作为一种有效的分析方法，非常适合痕量磺胺类药物的灵敏检测。然而，由于磺胺类药物残留在食品和饮用水中浓度极低或者样品基质非常复杂，磺胺类药物的直接检测一般比较困难。因此，当前迫切需要一种简便、快速和有效的样品前处理技术。
液液萃取、固相萃取、加速溶剂萃取、分散固相基质萃取、quechers技术以及分散液液微萃取已经被成功应用于环境和食品样品中痕量磺胺类药物残留的分离和富集。其中，固相萃取技术逐步取代传统的液液萃取成为一种有效的前处理方法。这种方法简单、快速，方便，溶剂消耗少，易实现自动化。固相萃取吸附剂在固相萃取的过程中起到至关重要的作用，传统的c18和hlb聚合物经常被用作spe吸附剂来富集环境和食品样品中的磺胺类抗生素残留。此外，许多新材料，比如多壁碳纳米管、石墨烯和分子印迹材料等也被用作固相萃取吸附剂。
金属-有机骨架材料(meta-organicframeworks,mofs)是一类以金属离子或金属簇为配位中心，与含氧或氮的有机配体通过配位作用形成的多孔配位聚合物材料。mofs材料具有比表面积大、种类多样、孔径尺寸可调和稳定性高等优点,已在气体储存、催化、传感、药物传输和成像等领域得到了广泛应用。mofs特独的结构特征和优异的性能也已在固相萃取中显示出良好的应用潜力。
技术实现要素：
现有技术中的磺胺类抗生素检测方法存在样品浓度低、基质复杂，检测方法灵敏度低等缺陷，针对以上技术问题，本发明提出一种采用锆-卟啉有机骨架材料(pcn-224)作为固相萃取吸附剂，液相色谱-串联质谱进行检测的分析方法，能够分析食品和饮用水中痕量的磺胺类抗生素。本发明检测方法的线性范围为0.5-2000ng/l，检出限为0.07-0.47ng/l，具备意料不到的检测效果。
为了实现以上技术目的，本发明提供以下技术方案：
本发明目的之一在于提供一种用于磺胺类抗生素的固相萃取吸附剂，该固相萃取吸附剂的成分为锆-卟啉有机骨架材料或90％以上为锆-卟啉有机骨架材料。
本发明研究过程中发现，锆-卟啉有机骨架材料对磺胺类抗生素具有良好的吸附效果，本发明还考察了pcn-224在不同ph值水溶液和有机溶剂中的化学稳定性，稳定性考察结果表明：本发明中的pcn-224材料在酸、碱溶液及有机溶剂中都非常稳定，作为固相萃取吸附剂具有巨大的潜力。采用pcn-224或90％以上的pcn-224材料作为磺胺类抗生素的固相萃取吸附剂，能够实现良好的富集效果。
优选的，上述磺胺类抗生素为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑中的一种。
本发明目的之二在于提供上述固相萃取吸附剂的制备方法，步骤如下：
(1)将八水合氧氯化锆和苯甲酸置于圆底烧瓶中，向烧瓶中加入n,n-二甲基甲酰胺，混合后超声直至混合物完全溶解；边搅拌边加入5,10,15,20-四羧基苯基卟啉，将混合物逐步升温至一定温度，并在该温度条件下搅拌一段时间；
(2)反应完成后，将反应体系高速离心，过滤既得锆-卟啉纳米粒子，用n,n-二甲基甲酰胺和丙酮交替洗涤得到的纳米粒子，一定温度下干燥既得锆-卟啉有机骨架材料。
优选的，步骤(1)中八水合氧氯化锆：苯甲酸：n,n-二甲基甲酰胺：5,10,15,20-四羧基苯基卟啉＝0.3g：3g：100ml：0.1g。
优选的，步骤(1)中将化合物混合后超声时间为30min，超声至化合物完全溶解，边搅拌边加入5,10,15,20-四羧基苯基卟啉，将混合物逐步升温至120℃，并在120℃条件下搅拌1h。
进一步优选的，将0.15g八水合氧氯化锆和1.5g苯甲酸置于100ml圆底烧瓶中，向烧瓶中加入50mln,n-二甲基甲酰胺，混合后超声30min直至混合物完全溶解。然后，边搅拌边加入0.05g5,10,15,20-四羧基苯基卟啉。混合物逐步升温至120℃，并在120℃条件下搅拌1h。
优选的，步骤(2)中高速离心的转速为15000rpm/min，离心时间30min；洗涤后的纳米粒子在50℃条件下干燥24h。
进一步优选的，步骤(1)的反应完成后，将混合样品置于15000rpm高速离心30min，过滤分离pcn-224纳米粒子，然后用n,n-二甲基甲酰胺和丙酮交替洗涤3次。最后，将制备出的pcn-224材料在50℃条件下干燥24h，既得pcn-224有机骨架材料。
本发明的目的之三在于提供一种磺胺类抗生素的检测方法，通过固相萃取将样品中的磺胺类抗生素富集后通过超高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱仪进行检测，其中，固相萃取采用锆-卟啉有机骨架材料作为吸附剂。
优选的，上述磺胺类抗生素为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑中的一种。
优选的，上述固相萃取采用填充pcn-224材料的固相萃取，萃取柱的下端与一个真空泵相连，上端与另一端浸入样品溶液中的ptfe管相连；在使用之前，所述固相萃取柱需要用超纯水和甲醇进行清洗和活化。
优选的，上述检测方法中，超高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱仪的检测条件如下：
超高液相色谱仪参数如下：色谱柱c18柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温箱：40℃；流速：0.3ml/min；进样体积为5μl；流动相：c相为乙腈，d相为0.1％甲酸水；洗脱梯度：0-3.0min，90％-80％c相；3-8min，80％-65％c相；8.1-14.0min，65％-40％c相；14.1-17min，90％c相；
质谱分析参数设置如下：气帘气：0.24mpa；离子喷雾电压设定为-4500v；离子源温度设定为650℃；雾化气设定为50psi；涡轮增压气设定为50psi；碰撞气和雾化气为氮气。
本发明目的之四在于提供上述固相萃取剂及固相萃取剂的制备方法，在磺胺类抗生素富集预处理方面的应用。面对水体或食物中的痕量磺胺类抗生素残留，样品量过低、基质过于复杂的问题，导致很多检测方法都无法适用。本发明的研究发现，pcn-224材料对磺胺类抗生素有良好的吸附性能，能够实现复杂待测样品中，痕量的磺胺抗生素的富集。该固相萃取技术不仅可以适用于液质串联的检测，能够适用于许多其他检测手段。采用pcn-224作为样品中磺胺样品富集预处理的应用，对于多种检测手段都具有重要意义。
本发明目的之五在于提供上述检测方法在食品或水体中磺胺类抗生素检测领域的应用。本发明研究过程中，考察了桶装饮用水、自来水、蜂蜜和牛奶样品作为实际样品中的检测，检测结果表明：本发明方法适用于一般水体、食品及复杂溶液环境，均具有良好的检测效果。
本发明的有益效果
1.本发明的研究发现，pcn-224材料对磺胺类抗生素有良好的吸附性能，作为固相萃取的吸附剂，能够对样品环境中痕量的磺胺类抗生素起到良好的富集作用，提高检测的精度，对于磺胺类抗生素检测方法的进一步开发，提供了研究方向。
2.本发明提供一种采用pcn-224作为固相萃取吸附剂，液相色谱-串联质谱进行检测的分析方法，能够分析食品和饮用水中痕量的磺胺类抗生素。本发明检测方法的线性范围为0.5-2000ng/l，检出限为0.07-0.47ng/l，相比现有技术的方法，具有显著的进步，且本发明方法能够适用于多种检测环境，具有重要的经济意义。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1实施例1制备方法得到的pcn-224表征图。
其中，图(a)为×10,000放大倍数下pcn-224纳米材料的sem图；
图(b)为×50,000放大倍数下pcn-224纳米材料的sem图；
图(c)为pcn-224纳米粒子的傅里叶红外光谱扫描结果图；
图(d)为pcn-224纳米粒子的xrd图：
其中，(a)表示在空气中的衍射结果，(b)表示在ph＝2的水溶液中浸泡24小时后衍射结果，(c)表示在ph＝7的水溶液中浸泡24小时后的衍射结果，(d)表示在ph＝12的水溶液中浸泡24小时后的衍射结果(e)表示在甲醇中浸泡24小时后的衍射结果。
图2不同实验条件对检测结果的影响图。
其中，图(a)表示不同解析液环境中，本发明检测方法对六种磺胺抗生素的回收率考察结果；
图(b)表示解析液体积不同情况下，本发明检测方法对六种磺胺抗生素检测回收率考察结果；
图(c)表示样品体积不同情况下，本发明检测方法对六种磺胺抗生素检测回收率考察结果；
图(d)表示ph不同情况下，本发明检测方法对六种磺胺抗生素检测回收率考察结果。
图3结果与讨论中蜂蜜样品检测的色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释部分:包括自定义术语、不常见术语、需要解释限定清楚的术语、引用文献涉及内容等、
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在磺胺类抗生素检测浓度低、检测方法精度低的缺陷，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种采用pcn-224为固相萃取吸附剂、采用液相色谱-串联质谱对食品及水体中痕量的磺胺类抗生素进行检测的方法。
本发明的一种典型实施方式中，提供一种用于磺胺类抗生素的固相萃取吸附剂，该固相萃取吸附剂的成分为锆-卟啉有机骨架材料或90％以上为锆-卟啉有机骨架材料。
优选的实施方案中，上述磺胺类抗生素为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑中的一种。
本发明的又一种典型实施方式中，提供上述固相萃取吸附剂的制备方法，步骤如下：
(1)将八水合氧氯化锆和苯甲酸置于圆底烧瓶中，向烧瓶中加入n,n-二甲基甲酰胺，混合后超声直至混合物完全溶解；边搅拌边加入5,10,15,20-四羧基苯基卟啉，将混合物逐步升温至一定温度，并在该温度条件下搅拌一段时间；
(2)反应完成后，将反应体系高速离心，过滤既得锆-卟啉纳米粒子，用n,n-二甲基甲酰胺和丙酮交替洗涤得到的纳米粒子，一定温度下干燥既得锆-卟啉有机骨架材料。
优选的实施方式中，步骤(1)中八水合氧氯化锆：苯甲酸：n,n-二甲基甲酰胺：5,10,15,20-四羧基苯基卟啉＝0.3g：3g：100ml：0.1g。
优选的实施方式中，步骤(1)中将化合物混合后超声时间为30min，超声至化合物完全溶解，边搅拌边加入5,10,15,20-四羧基苯基卟啉，将混合物逐步升温至120℃，并在120℃条件下搅拌1h。
进一步优选的实施方式中，将0.15g八水合氧氯化锆和1.5g苯甲酸置于100ml圆底烧瓶中，向烧瓶中加入50mln,n-二甲基甲酰胺，混合后超声30min直至混合物完全溶解。然后，边搅拌边加入0.05g5,10,15,20-四羧基苯基卟啉。混合物逐步升温至120℃，并在120℃条件下搅拌1h。
优选的实施方式中，步骤(2)中高速离心的转速为15000rpm/min，离心时间30min；洗涤后的纳米粒子在50℃条件下干燥24h。
进一步优选的实施方式中，步骤(1)的反应完成后，将混合样品置于15000rpm高速离心30min，过滤分离pcn-224纳米粒子，然后用n,n-二甲基甲酰胺和丙酮交替洗涤3次。最后，将制备出的pcn-224材料在50℃条件下干燥24h，既得pcn-224有机骨架材料。
本发明的有一种典型实施方式中，提供一种磺胺类抗生素的检测方法，通过固相萃取将样品中的磺胺类抗生素富集后通过超高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱仪进行检测，其中，固相萃取采用锆-卟啉有机骨架材料作为吸附剂。
优选的实施方式中，上述磺胺类抗生素为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑中的一种。
优选的实施方式中，上述固相萃取采用填充pcn-224材料的固相萃取，萃取柱的下端与一个真空泵相连，上端与另一端浸入样品溶液中的ptfe管相连；在使用之前，所述固相萃取柱需要用超纯水和甲醇进行清洗和活化。
优选的实施方式中，上述检测方法中，超高效液相色谱仪-串联三重四极杆质谱仪的检测条件如下：
超高液相色谱仪参数如下：色谱柱c18柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温箱：40℃；流速：0.3ml/min；进样体积为5μl；流动相：c相为乙腈，d相为0.1％甲酸水；洗脱梯度：0-3.0min，90％-80％c相；3-8min，80％-65％c相；8.1-14.0min，65％-40％c相；14.1-17min，90％c相；
质谱分析参数设置如下：气帘气：0.24mpa；离子喷雾电压设定为-4500v；离子源温度设定为650℃；雾化气设定为50psi；涡轮增压气设定为50psi；碰撞气和雾化气为氮气。
本发明的又一种典型实施方式中，提供上述固相萃取剂及固相萃取剂的制备方法，在磺胺类抗生素富集预处理方面的应用。
本发明的又一种典型实施方式中，提供上述检测方法在食品或水体中磺胺类抗生素检测领域的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。
实施例1
1.pcn-224的制备
将0.15g八水合氧氯化锆和1.5g苯甲酸置于100ml圆底烧瓶中，向烧瓶中加入50mln,n-二甲基甲酰胺，混合后超声30min直至混合物完全溶解。然后，边搅拌边加入0.05g5,10,15,20-四羧基苯基卟啉。混合物逐步升温至120℃，并在120℃条件下搅拌1个小时。反应完成后，15000rpm高速离心30min，将pcn-224纳米粒子分离出来，然后用n,n-二甲基甲酰胺和丙酮交替洗涤3次。最后，将制备出的pcn-224材料在50℃条件下干燥24小时。
2.固相萃取的制备
pcn-224材料固相萃取柱的制作步骤如下：取3ml固相萃取柱，填入250mgpcn-224材料，将筛板固定在固相萃取柱的上端以固定柱中的pcn-224。然后将萃取柱的下端与一个真空泵相连，上端与另一端浸入样品溶液中的ptfe管相连。在使用之前，固相萃取柱需要用超纯水和甲醇进行清洗和活化。
3.样品采集与处理
采集桶装饮用水、自来水、蜂蜜和牛奶作为实际样品。蜂蜜需按照国标gb/t18932.17-2003和文献方法进行处理：称取5克蜂蜜于50ml离心管中，向其中加入10ml2mol/l的盐酸并且充分涡旋，并于50℃水浴中保持1小时。牛奶需按照国标gb/t22966-2008和文献方法进行处理：称取2克纯牛奶于50ml离心管中，向其中加入25mlph＝2的高氯酸，先涡旋1分钟，然后超声10分钟。最后，10000rpm高速离心10min收集上清液。无论是桶装饮用水、自来水还是处理好的蜂蜜、牛奶样品均需要0.45μm微孔滤膜过滤，然后4℃条件下储存于棕色玻璃瓶中待用。
4.仪器条件
超高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪；色谱柱c18柱(150mm×2.1mm，5μm)；柱温箱：40℃；流速：0.3ml/min；进样体积为5μl；流动相：c为乙腈，d为0.1％甲酸水；洗脱梯度：0-3.0min，90％-80％c；3-8min,80％-65％c；8.1-14.0min，65％-40％c；14.1-17min，90％c。质谱分析参数设置如下：气帘气：0.24mpa；离子喷雾电压设定为-4500v；离子源温度设定为650℃；雾化气设定为50psi；涡轮增压气设定为50psi。碰撞气和雾化气为氮气。
5.样品检测
将处理后的待测样品用水稀释至100ml，然后用1mol/l的盐酸和氢氧化钠调节至ph＝4，四个样品分别添加10、50和100ng/l的磺胺类化合物，以验证方法的可行性，将固相萃取柱用5-10ml甲醇活化，100ml样品溶液通过固相萃取柱后，用10ml甲醇解析目标物至10ml离心管中，40℃下氮吹至完全干燥，用1ml甲醇复溶，过0.22μm有机相滤膜，然后进lc-ms/ms，记录检测结果。
实施例2
由仪器检出限确定水样中加标浓度为0.05ng/l来确定方法检出限，选择优化后的最优条件：甲醇10ml作为解析溶剂，样品流速选取为3ml/min，100ml为水样体积，ph＝4为最终溶液的ph值，解析液40℃下氮吹至完全干燥，1ml甲醇复溶，过0.22μm有机相滤膜，然后进lc-ms/ms，记录检测结果。计算得到s/n＝3时的检出限为0.07-0.47ng/l，同样的方法计算得到s/n＝10时的定量限为0.24-1.56ng/l，不同的化合物在其定量限以上选取5-6个点得到化合物的线性范围，保证实验条件不变，在一天内选择早、中、晚三个时间段内进行实验，得到日内偏差，选择一周内的周一、周三、周五三天进行实验，得到日间偏差。本发明检测方法通过方法学验证，在优化条件下，方法的线性范围为0.5-2000ng/l，相关系数r≥0.996。以信噪比s/n＝3计,六种磺胺类化合物的检出限为0.07-0.47ng/l，低于其他文献报道的方法。采用100ng/l磺胺类化合物进行重复性实验,日内和日间相对标准偏差分别为3.9-6.6％和2.8-6.7％。
结果与讨论
1.pcn-224的表征
在扫描电镜(sem)下，制备的pcn-224纳米粒子呈现球状，颗粒均匀，粒径约为90-100nm(图1a和1b)。傅里叶红外光谱(图1c)表明pcn-224在1653.87cm-1由于c＝o的弹性振动有一个吸收峰，在大约1418.23和3400.83cm-1处的两个吸收峰分别是由于c-n基团的弯曲振动和羟基的弹性振动。此外，在1604.29和1546.24cm-1两处的吸收峰表明在pcn-224上有苯环的存在。
化学稳定性是决定新材料是否能成为一种实用固相萃取吸附剂的重要条件。考察了pcn-224在不同ph值水溶液和有机溶剂中的化学稳定性。图1d表明：经过不同条件处理后的卟啉金属有机骨架的xrd图像没有明显的变化，这表明卟啉金属有机骨架在ph＝2,7,10的水溶液中以及有机溶剂中都非常稳定。因此，pcn-224具有作为固相萃取吸附剂的巨大潜力。
2.固相萃取条件优化
为了获得最佳的实验效果，对影响固相萃取效果的重要参数：解析液种类和体积，样品流速、溶液ph值、样品的体积进行了优化。100ml超纯水添加10μg/l磺胺类化合物标样(磺胺嘧啶，磺胺噻唑，磺胺吡啶，磺胺甲基嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲恶唑)来评估pcn-224作为固相萃取吸附剂的富集能力。发明研究过程中，采用这些化合物的回收率来评价实验效果。
解析液种类是固相萃取过程中的最重要的影响因素之一。本发明研究中，选取五种有机溶剂：甲醇、乙腈、丙酮、正己烷和二氯甲烷作为解析溶剂，五种溶剂的解析效果展现在图2a中。在这五种有机溶剂中，甲醇对于磺胺类化合物具有最好的解析效果，因此，选择甲醇作为后续实验的解吸溶剂。
解吸溶剂体积也是对解析效果有重要影响的一个因素，如图2b所示，随着解析液体积从2ml增加到10ml，解析效率逐渐增加；当解析液体积大于10ml时，解析效率不再有明显增加。最终，选择10ml作为后续实验中的解析液体积。
样品的流速也是应该被考虑的至关重要的一个因素，因为这直接影响着目标分析物和固相萃取吸附剂的接触时间。本发明研究了2-5ml/min的流速对样品富集效果的影响。当流速介于2-3ml/min时，对磺胺的回收率没有明显影响；但是随着流速增加至4-5ml/min回收率逐步下降。因此，为了节省萃取时间和获得满意的实验效果，在后续的实验中，样品流速选取为3ml/min。
样品体积是固相萃取过程中另一个需要考虑的因素。考察了样品体积100-1000ml对于六种化合物回收率的影响。如图2c所示，在100-1000ml范围内六种目标物的回收率受水样体积影响较小。为了节约检测时间，选取100ml的水样体积作为检测体积。
此外，样品溶液的ph值也在固相萃取过程中发挥着非常重要的作用。考察了样品溶液的ph值2-10对实验结果的影响(图2d)。当ph值从2变化到4时，回收率明显升高，在ph值＝4时，六种污染物的回收率最高；然后，随着ph值的升高，磺胺的回收率逐步降低。因此，溶液ph值最终选定为4。
3.实际样品分析
为了检验该方法的可靠性，选取桶装饮用水、自来水、蜂蜜和牛奶来考察方法的可行性。四个样品中只有蜂蜜中检测出磺胺二甲基嘧啶，浓度为10.2ng/kg。四个样品分别添加10、50和100ng/l的磺胺类化合物，加标回收率在87.3-114.6％，这说明不同样品的基质效应对该方法没有显著的影响，这可以满足实际样品痕量分析的要求。其中蜂蜜样品的色谱检测结果如附图3所示。如以上实验结果表明pcn-224应用于食品和饮用水中痕量磺胺类抗生素的分析是可行的。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。