一种无猝灭剂荧光探针CP-DNA及其制备方法、应用和检测微量Pb2+的方法与流程

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种无猝灭剂荧光探针cp-dna及其制备方法、应用和检测微量pb²⁺的方法。

背景技术

铅是重金属中对人类健康危害最普遍的环境毒和神经毒，其化合物在常温下不易被氧化且耐腐蚀。因此环境中的铅，经过食物链进入生物体后，易在人体内富集。铅对人体内的大多数系统均有危害，如脑损伤、肾衰竭、神经系统以及免疫系统损伤等。即使低浓度的铅对婴幼儿和儿童的生长发育有重要的影响，尤其是损伤学习记忆等脑功能，严重中毒性这造成智力低下甚至痴呆。因此，我们迫切需要开发一种快速、简单且高效的铅离子检测新体系和方法。

传统的铅离子(pb²⁺)检测的主要方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体光谱法、电化学检测法等。然而，这些方法要求有昂贵的仪器、复杂的样品预处理过程，并引起记忆效应，限制其实际应用。近年来，研究工作者们开发了一系列以荧光探针为基础的荧光分析法检测铅离子，但这些方法需要对荧光探针进行双标记，既需要荧光基团，又需要猝灭基团或辅助基团，增加检测成本、降低检测的可靠性。

因此，研究一种无需双标记，检测成本低且可靠性高的荧光探针具有重要的研究意义和应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中荧光探针需要双标记，成本高，可靠性低的缺陷和不足，提供一种无猝灭剂荧光探针cp-dna。本发明提供的探针为单标记荧光探针，无需猝灭剂即可实现1nm~10ppm的微量pb²⁺检测，响应速度快，检测限低，成本低廉。

本发明的另一目的在于提供上述探针的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述探针在检测微量pb²⁺中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测微量pb²⁺的方法。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种无猝灭剂荧光探针cp-dna，所述探针的结构式如式（ⅰ）：

，

所述探针的最小分子量为11465，n>1。

本发明提供的探针将具有聚集诱导荧光猝灭特性的导电高分子(cp)与dna探针分子：5’-ggaaggtgtggaagg-3’共价键结合，构建无猝灭剂荧光探针cp-dna。在无pb²⁺存在时，无猝灭剂荧光探针cp-dna的疏水部分cp分子处于聚集状态，由于cp分子的聚集诱导荧光猝灭（acq）特性，探针的荧光猝灭；在有pb²⁺存在时，无猝灭剂荧光探针cp-dna的亲水部分dna与pb²⁺特异性结合，形成g-四联体结构，由于空间位阻的影响，其疏水部分cp分子处于分散状态，荧光释放，通过监测荧光信号变化，实现对pb²⁺检测。

本发明提供的探针为单标记荧光探针，灵敏度高，检测下限为10ppm，可靠性高，成本低廉。

优选地，所述探针的平均分子量为13633。

本发明提供一种上述无猝灭剂荧光探针cp-dna的制备方法，所述方法包括如下步骤：

s1：将式（ⅱ）所示的聚芴cp的羧基活化；

s2：在dna序列：ggaaggtgtggaagg的5’端修饰上氨基得如式（ⅲ）所示的修饰dna；

s3：s1活化后的聚芴cp与s2修饰dna反应即得所述无猝灭剂荧光探针cp-dna。

通过对聚芴cp活化和dna的5’端修饰氨基，可实现两者的共价键结合得到目标探针。

dna序列如下：ggaaggtgtggaagg（5’-ggaaggtgtggaagg-3’）。

可选用常规的活化剂实现聚芴cp的羧基活化，优选地，s1中利用nhs和dcc对聚芴cp进行活化。

更为优选地，所述聚芴cp、nhs和dcc的摩尔比为1:4:8。

优选地，s3中活化后的聚芴cp与修饰dna的摩尔比为不大于1:1.5。修饰dna适当过量可实现两者较好的结合且不浪费原料。

更为优选地，s3中活化后的聚芴cp与修饰dna的摩尔比为1:3。

优选地，s3中反应的温度为25~30℃，搅拌至少24h。

上述无猝灭剂荧光探针cp-dna在检测微量pb²⁺中的应用也在本发明的保护范围内。

如了检测到1nm浓度的pb²⁺，即可称为实现了微量检测。

优选地，所述无猝灭剂荧光探针cp-dna在检测环境水样中微量pb²⁺的应用。

如下线路，为无猝灭剂荧光探针cp-dna的制备路线的示例：

一种检测微量pb²⁺的方法，所述方法包括如下步骤：

s5：将待测液和上述的无猝灭剂荧光探针cp-dna于ph为7.4±0.07的缓冲溶液中混合得反应液，所述反应液中探针的浓度不低于250nmol/l；

s6：反应液在25~37℃下反应至少10min后检测反应液的荧光强度即可得到所述待测液中pb²⁺的含量。

检测时的ph是影响检测结果的关键条件之一，这主要是因为ph影响无猝灭剂荧光探针cp-dna的疏水部分cp的发光性能。本发明的发明人经探索后发现当ph严格控制在7.4±0.07时可实现高灵敏度和可靠性检测。

优选地，s5中所述缓冲溶液的ph为7.4。

优选地，s5中所述缓冲溶液为pbs。

优选地，s5中所述反应液中探针的浓度为250nmol/l。

优选地，s5中所述待测液中pb²⁺的浓度为1nm~10ppm。

优选地，s6中所述反应液在30℃下反应10min。

优选地，s6中荧光检测的激发波长为340nm；发射扫描范围为390~520nm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的探针为单标记荧光探针，将具有聚集诱导荧光猝灭特性的导电高分子(cp)与dna探针分子：5’-ggaaggtgtggaagg-3’共价键结合，构建无猝灭剂荧光探针cp-dna。在无pb²⁺存在时，无猝灭剂荧光探针cp-dna的疏水部分cp分子处于聚集状态，由于cp分子的聚集诱导荧光猝灭（acq）特性，探针的荧光猝灭；在有pb²⁺存在时，无猝灭剂荧光探针cp-dna的亲水部分dna与pb²⁺特异性结合，形成g-四联体结构，由于空间位阻的影响，其疏水部分cp分子处于分散状态，荧光释放，通过监测荧光信号变化，实现对pb²⁺检测。本方法检测灵敏度高，检测下限为10ppm，可靠性高，成本低廉。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的探针检测pb²⁺的原理图；

图2是本发明实施例2提供的检测方法在30℃下检测pb²⁺的现象图；

图3是本发明实施例4提供的检测方法在30℃下检测pb²⁺的的浓度曲线图；。

图4是本发明实施例4提供的检测方法的检测特异性柱状图；

图5是本发明的检测方法检测实际环境水样中铅离子的可靠性图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种无猝灭剂荧光探针cp-dna，其结构式如式（ⅰ）：

，探针的平均分子量为13633。

该探针的制备方法如下：

（1）利用nhs和dcc将式（ⅱ）所示的聚芴cp（平均分子量为7168，n>1）的羧基活化，聚芴cp、nhs和dcc的摩尔比为1:4:8

（2）设计dna序列为ggaaggtgtggaagg的探针分子，并在5’端修饰上氨基得如式(ⅲ)所示的修饰dna。

（3）活化后的聚芴cp与修饰dna按1:3的摩尔比，于温度为25℃~30℃，搅拌24小时条件下反应，反应产物通过反向高效液相色谱纯化，最后得到的产物如式（ⅰ）所示的荧光探针分子。

如要得到其它分子量（如平均分子量为11465）的荧光探针，可选用其它分子量的聚芴cp（如平均分子量为5000，n>1），其余步骤与条件与前述一直，在此不再赘述。

实施例2

以实施例1提供的无猝灭剂荧光探针cp-dna为例，对其检测pb²⁺的效果进行测定。

以商业购买的pb(no3)2为待测物，配置1mm溶液。取2个1.5ml离心管，向其中1个离心管中加入无猝灭剂荧光探针cp-dna和pbs缓冲溶液；向另1个离心管中加入无猝灭剂荧光探针cp-dna、pb(no3)2水溶液和pbs缓冲溶液。2个离心管中的反应总体积均为50μl，无猝灭剂荧光探针cp-dna浓度均为250nm/l，在30℃下反应10分钟后立即测量荧光值。其荧光光谱测量条件为：电压是600v，激发波长为340nm，发射扫描范围为：390~520nm。

步骤二：取8个1.5ml离心管，并向其中加入相同浓度的无猝灭剂荧光探针cp-dna、不同浓度梯度的pb(no3)2水溶液和pbs缓冲溶液。反应条件和测试条件与步骤一中反应条件和测试条件相同。

步骤三：取8个1.5ml离心管，分别向其中加入等浓度的无猝灭剂荧光探针cp-dna、金属离子等浓度的cacl2水溶液、mgso4水溶液、cocl2水溶液、hgso4水溶液、pb(no3)2水溶液、cuso4水溶液、zn(no3)2水溶液和pbs缓冲溶液。反应条件和测试条件与步骤一中反应条件和测试条件相同。

该探针检测pb²⁺的原理图如图1，在无pb²⁺存在时，无猝灭剂荧光探针cp-dna的疏水部分cp分子处于聚集状态，由于cp分子的聚集诱导荧光猝灭（acq）特性，探针的荧光猝灭；在有pb²⁺存在时，无猝灭剂荧光探针cp-dna的亲水部分dna与pb²⁺特异性结合，形成g-四联体结构，由于空间位阻的影响，其疏水部分cp分子处于分散状态，荧光释放，通过监测荧光信号变化，实现对pb²⁺检测。

图2为检测pb²⁺的现象图，从图中可以看出，在引入pb²⁺后，其荧光强度大幅增强，说明本方法可用于定量检测pb²⁺。

图3为检测pb²⁺的的浓度曲线图，从图中可以看出，随着pb²⁺浓度的增加，无猝灭剂荧光探针cp-dna的荧光强度逐步增强。该方法检测pb²⁺的浓度范围为1nm~10ppm，检测限为10ppm。

图4为检测特异性柱状图。从图中可以看出，当无猝灭剂荧光探针cp-dna的pbs溶液引入1nmpb²⁺时，其荧光强度大幅增强，而当引入其它等浓度的二价金属离子时，其荧光强度基本无变化，说明该方法应用于pb²⁺检测时，特异性强。

实施例3

以实施例1提供的无猝灭剂荧光探针cp-dna为例，对环境水样中的pb²⁺的含量进行测定。

步骤一：取5个1l的玻璃瓶，分别加入长江江水、黄河河水、南海海水、东湖湖水、自来水，25℃~30℃静置2星期。取上层清液离心(10000rpm/min)，离心5分钟后，取上层清液，并用13μm的滤头过滤。

步骤二：取6个1.5ml离心管，分别向其中加入等浓度的无猝灭剂荧光探针cp-dna、步骤一中长江江水滤液配制的pb(no3)2江水溶液、步骤一中黄河河水滤液配制的pb(no3)2河水溶液、步骤一中南海海水滤液配制的pb(no3)2海水溶液、步骤一中瑞云湖湖水滤液配制的pb(no3)2湖水溶液、步骤一中自来水滤液配制的pb(no3)2自来水溶液、pb(no3)2超纯水溶液和pbs溶液。反应条件和测试条件与实例1步骤一中反应条件和测试条件相同。

图5为检测实际环境水样中铅离子的可靠性图。从图中可以看出，用该方法检测实际环境水样中pb²⁺的检测结果与icp-ms的检测结果基本一致。说明该方法应用于pb²⁺检测时，实际应用性强。