本发明属于三维成像技术领域，具体地涉及一种光学三维成像系统及光学三维成像方法。
背景技术
随着生物医学研究的日益发展，光学三维成像技术由于其可以获取样品三维空间信息而逐渐成为现代生物和医学等研究领域的重要工具。目前在细胞三维成像方面应用较为广泛的是激光扫描共聚焦显微镜和超分辨荧光显微镜。这类显微镜可分辨样品纳米尺度的精细结构，但光路复杂、设备昂贵，荧光标记物会对活性生物样品产生光毒和光漂白作用，且需要使用机械部件对样品进行调焦或扫描，在细胞膜波动等快速动态测量应用中存在不足。光学衍射层析成像方法结合了定量相位成像方法与衍射层析技术的优势，通过旋转照明光束或旋转样品获取样品在一系列不同方向上的干涉场，并通过傅立叶衍射层析重建算法获得样品内部三维折射率分布，从而精确探索样品形态和内部精细结构信息。光学衍射层析具有无标记、非侵入和定量化等优势，已成为显微成像领域新的研究热点并进入快速发展阶段。
随着光学衍射层析成像研究的深入和光电技术的快速发展，快速地获取活细胞的高分辨率三维折射率图像已成为光学衍射层析发展的重要需求之一。光学衍射层析系统的扫描光路结构直接决定了三维折射率成像速度、精度和分辨率。光学衍射层析干涉结构主要采用相移干涉法和离轴干涉法。相移干涉法需要采集两幅或四幅干涉图像提取相位信息，耗时长，不适合用于活细胞的实时监测。离轴干涉法主要包括马赫-曾德(mz)干涉结构和共光路干涉结构。在光学衍射层析扫描光路结构方面，主要包括照明光束扫描和旋转样品两种方式。当前，几乎所有的照明光束扫描都是通过扫描振镜实现的，存在机械不稳定性和角度模糊问题，达到相对稳定的时间较长(毫秒级)；同时，双轴振镜的两个镜面不可能同时与样品共轭，会在入射波前中引入附加像差。这些因素导致了振镜扫描光学衍射层析无法快速地实现三维折射率的高精度重构。样品旋转方案需要在样品处添加折射率匹配液，会造成光场畸变,同时机械旋转伴随的寄生运动以及旋转过程中细胞的黏弹性引起的细胞变形也会降低重构精度，目前应用较少。在光学衍射层析干涉结构方面，目前大都采用mz干涉结构，物光和参考光空间上分离，易受到环境扰动的影响，相位随时间变化不稳定性显著。
技术实现要素：
为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种可提高三维成像速度和稳定性，降低附加像差的光学三维成像系统及光学三维成像方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
根据本发明的一方面，提供了一种光学三维成像系统，包括：激光光源以及设置于所述激光光源的出射光路上的第一空间滤波器、第一数字微镜器件、第二空间滤波器、扫描角度范围放大器、物镜、筒镜、第二数字微镜器件、分光器、第三空间滤波器、轴向扫描器和图像获取装置，所述激光光源出射的光束依次经过所述第一空间滤波器、所述第一数字微镜器件后形成环形扫描衍射光，所述环形扫描衍射光经过所述第二空间滤波器、所述扫描角度范围放大器、所述物镜、所述筒镜、所述第二数字微镜器件后形成具有样品信息的样品光，所述样品光经过所述分光器分光后形成两个光束，所述两个光束经过所述第三空间滤波器、所述轴向扫描器后成像在所述图像获取装置上。
进一步地，所述第一空间滤波器包括第一透镜、第二透镜及设置于所述第一透镜与所述第二透镜之间的第一光阑，所述第二透镜位于第一光阑与第一数字微镜器件之间，所述第一光阑位于所述第一透镜的后焦平面处，所述第一透镜的后焦平面与所述第二透镜的前焦平面重合，所述第一透镜为平凸透镜或双凸透镜，所述第二透镜为平凸透镜或双凸透镜。
进一步地，所述第一数字微镜器件包括形成环形扫描衍射光的全息图序列。
进一步地，所述第二空间滤波器包括第三透镜、第四透镜及设置于所述第三透镜与所述第四透镜之间的第二光阑，所述第三透镜位于第二光阑与第一数字微镜器件之间，所述第二光阑位于所述第三透镜的后焦平面处，所述第四透镜的后焦平面与所述第三透镜的前焦平面重合，所述第三透镜的焦距与所述第四透镜的焦距相同，所述第三透镜为平凸透镜或双凸透镜，所述第四透镜为平凸透镜或双凸透镜。
进一步地，所述扫描角度范围放大器包括第五透镜和聚光镜，所述第五透镜设置于所述第四透镜与所述聚光镜之间，所述第五透镜设置于所述第四透镜的后焦平面处，所述第五透镜的后焦平面与所述聚光镜的前焦平面重合，所述第五透镜为平凸透镜或双凸透镜。
进一步地，所述第三空间滤波器包括第六透镜、第七透镜及设置于所述第六透镜与所述第七透镜之间的第三光阑，所述第六透镜位于分光器与第七透镜之间，所述第三光阑位于所述第六透镜的后焦平面处，所述第六透镜的后焦平面与所述第七透镜的前焦平面重合，所述第六透镜为平凸透镜或双凸透镜，所述第七透镜为平凸透镜或双凸透镜。
进一步地，所述轴向扫描器包括第八透镜、第九透镜及设置于所述第八透镜与所述第九透镜之间的第十透镜，所述第八透镜位于第九透镜与第三空间滤波器之间，所述第十透镜位于所述第八透镜的后焦平面处，所述第八透镜的后焦平面与所述第九透镜的前焦平面重合，所述第八透镜为平凸透镜或双凸透镜，所述第九透镜为平凸透镜或双凸透镜。
进一步地，所述第十透镜为变焦透镜。
根据本发明的另一方面，还提供了一种采用上述的光学三维成像系统的光学三维成像方法，包括步骤：
将所述第十透镜的焦距设置为多个不同的焦距；
所述图像获取装置分别获取所述第十透镜在每个焦距下的待测样品的局部的三维折射率分布图；
将所有局部三维折射率分布图采用缝合算法合成完整的三维折射率分布图。
本发明的有益效果：
1、本发明通过数字微镜器件代替现有的扫描振镜进行环形扫描照明，可提高成像速度和稳定性，降低附加像差，大大提高时空稳定性。
2、更进一步地，本发明加入轴向扫描模块，提升轴向折射率精度一致性，最大程度减小了三维重建折射率图的误差。
附图说明
通过结合附图进行的以下描述，本发明的实施例的上述和其它方面、特点和优点将变得更加清楚，附图中：
图1是根据本发明的实施例一的光学三维成像系统的结构示意图；
图2是根据本发明的实施例的样品的侧视图；
图3是根据本发明的实施例二的光学三维成像方法的流程示意图。
具体实施方式
以下，将参照附图来详细描述本发明的实施例。然而，可以以许多不同的形式来实施本发明，并且本发明不应该被解释为限制于这里阐述的具体实施例。相反，提供这些实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例和适合于特定预期应用的各种修改。在附图中，为了清楚起见，可以夸大元件的形状和尺寸，并且相同的标号将始终被用于表示相同或相似的元件。
将理解的是，尽管在这里可使用术语“第一”、“第二”等来描述各种元件，但是这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个元件与另一个元件区分开来。
在下面的透镜结构图中，为了便于解释，透镜的厚度、尺寸和形状已经被略微地扩大。
具体地，所述透镜结构图中示出的球面或非球面的形状仅仅是以示例的方式示出。也就是说，球面或非球面不局限于示出的形状。
此外，应当注意的是，术语“前焦平面”指的是透镜朝向入射光束的方向的焦平面，而术语“后焦平面”指的是透镜朝向出射光束的方向的焦平面。
实施例一
图1是根据本发明的实施例一的光学三维成像系统的结构示意图；
参照图1，本实施例提供的光学三维成像系统包括：激光光源100、依次远离激光光源100并设置于光源100的出射光路上的第一空间滤波器200、第一数字微镜器件d1、第二空间滤波器300、扫描角度范围放大器400、物镜500、筒镜600、第二数字微镜器件d2、分光器700、第三空间滤波器800、轴向扫描器900及图像获取装置a。光源100出射的光束依次经过第一空间滤波器200、第一数字微镜器件d1后形成环形扫描衍射光，环形扫描衍射光经过第二空间滤波器300、扫描角度范围放大器400、物镜500、筒镜600、第二数字微镜器件d2后形成具有样品信息的样品光，样品光经过分光器700分光后形成两个光束，两个光束经过第三空间滤波器800、轴向扫描器900后成像在图像获取装置a上。可以理解的是，本发明并不限制于此，根据本发明的实施例的光学三维成像系统还可以包括其它必要的部件，如对图像获取装置a获取的数据进行处理的处理器等，本发明对此不作限制。
待测样品s放置于扫描角度范围放大器400与物镜500之间。激光光源100发出的光束经过第一空间滤波器200、第一数字微镜器件d1、第二空间滤波器300后形成环形扫描衍射光。
环形扫描衍射光经过扫描角度范围放大器实现照明角度放大之后照射待测样品s形成携带有样品信息的样品光，样品光入射至物镜500，样品光经物镜500放大后反射至筒镜600，从筒镜600出射的样品光再被分光器700分成两个光束即信号光和参考光。
本实施例中的分光器700为光栅，光栅能够将样品光分出两个衍射光束即信号光和参考光。本实施例中的激光光源100可以为高稳定性的氦氖激光、半导体激光和光纤激光等，采用激光光源可以避免光晕，提高了分光器分出的两个光束的相干性，降低了空间噪声的影响。本实施例中的图像获取装置a为相机。
具体的，第一空间滤波器200包括第一透镜210、第二透镜220及设置于第一透镜210与第二透镜220之间的第一光阑230。第二透镜220位于第一光阑230与第一数字微镜器件d1之间，第一光阑230位于第一透镜210的后焦平面处，第一透镜210的后焦平面与第二透镜220的前焦平面重合。本实施例中，第一透镜210、第二透镜220可根据需要选择平凸透镜或者双凸透镜。入射光束经过第一光阑230滤波后可得到高信噪比的准直光，即经过第一光阑230滤波后的出射光束的光束质量因子m2小于1.1。第一光阑230的孔径大小决定于激光光源100的光斑大小以及第一透镜210的焦距与第二透镜220的焦距。第一透镜210与第二透镜220的焦距根据具体地情况进行设计。
经过第二透镜220的出射光束照射到第一数字微镜器件d1，第一数字微镜器件d1产生环形扫描衍射光。数字微镜器件是由数百万个可以独立控制开关状态的微镜组成，将二进制图像显示在数字微镜上从而实现对每个微镜的控制。数值计算的全息图是一系列二进制数值，全息图图像的像素与数字微镜器件的像素对应，将全息图序列加载到数字微镜器件上，可以控制数字微镜器件上对应的微镜。每一副全息图可形成某一个角度的照明光束，多幅全息图可以形成多个角度的照明光束。在本发明的实施例中，第一数字微镜器件d1加载的全息图序列是为了形成环形扫描衍射光束，即形成多个角度的照明衍射光束对待测样品进行扫描。优选地，本发明的实施例的全息图是采用lee型全息图。
具体地，第二空间滤波器300包括第三透镜310、第四透镜320及设置于第三透镜310与第四透镜320之间的第二光阑330。第三透镜310位于第二光阑330与第一数字微镜器件d1之间，第二光阑330位于第三透镜310的后焦平面处，第四透镜320的后焦平面与第三透镜310的前焦平面重合。在本实施中，第三透镜310的焦距与第四透镜320的焦距相同，第三透镜310与第四透镜320的焦距根据具体地情况进行设计。在本实施例中，第三透镜310、第四透镜320可以根据需要选择平凸镜或者双凸镜。作为本发明的一种实施方式，第二光阑330用于选出+1级衍射光。作为本发明的一种实施方式，第二光阑330包括中心小孔和与中心小孔同心的环形孔，孔径大小决定于光源的光斑大小与第三透镜310的焦距。
为了实现环形扫描光束与光轴之间的夹角的放大，本实施例的光学三维成像系统还包括扫描角度范围放大器400。扫描角度范围放大器400设置于第二空间滤波器300与物镜500之间。本实施例中，扫描角度范围放大器400包括第五透镜410和聚光镜420。第五透镜410设置于第四透镜320与聚光镜420之间。第五透镜410设置于第四透镜320的后焦平面处。第五透镜410的后焦平面与聚光镜420的前焦平面重合。第五透镜410的焦距和聚光镜420的焦距取决于所需要的环形扫描衍射光的角度放大倍率，放大后角度不能超过物镜500的孔径半角。
具体地，在筒镜600和分光器700之间设置有第二数字微镜器件d2。第二数字微镜器件d2用于保持从筒镜600出射的样品光的方向不变。具体地，第二数字微镜器件d2与第一数字微镜器件d1保持同步。即第二数字微镜器件d2加载有与第一数字微镜器件d1保持同步的相关的全息图序列，并且同时工作。
具体地，第三空间滤波器800包括第六透镜810、第七透镜820及设置于第六透镜810与第七透镜820之间的第三光阑830。第六透镜810位于分光器700与第七透镜820之间。第三光阑830位于第六透镜810的后焦平面处。第六透镜810的后焦平面与第七透镜820的前焦平面重合。在本实施例中，第六透镜810的焦距、第七透镜820的焦距根据具体地情况进行设计。在本实施例中，第六透镜810、第七透镜820可以根据需要选择平凸镜或者双凸镜。作为本发明的一种实施方式，第三光阑830用于包括两个孔，一个大孔和一个小孔。经过分光器的出射光束中的+1级衍射光经过小孔滤波后作为参考光，0级衍射光完全通过大孔后作为信号光。大孔是为了保证信号光完整无损的通过并且只通过信号光。小孔起到对参考光进行滤波的作用。小孔的孔径取决于经过分光器后的+1级衍射光的光斑的大小，大孔的孔径取决于经过分光器后的0级衍射光的光斑的大小。
具体地，轴向扫描器900包括第八透镜910、第九透镜920及设置于第八透镜910与所述第九透镜920之间的第十透镜930。第八透镜910位于第九透镜920与第三空间滤波器800之间。第十透镜930位于第八透镜910的后焦平面处。第八透镜910的后焦平面与第九透镜920的前焦平面重合。经过第三空间滤波器800的两个光束，即0级衍射光和+1级衍射光经过轴向扫描器后发生干涉并成像在图像获取装置a上，获得待测样品s轴向上的不同角度照明光下的干涉光场图。进一步采用光学衍射重建算法(如：利托夫近似算法)对获取的干涉光场图进行处理获得待测样品的三维折射率分布，实现折射率高度重建。
本实施例的光学三维成像系统采用第一数字微镜器件d1形成环形扫描衍射光，对于活的检测体的检测上具有重要的突破。活的检测体，如细胞等，本实施例的光学三维成像系统不需要对检测体进行荧光标记，可以在不破坏检测体活性的前提下对活的检测体的运动变化过程进行实时观测。
为了对光路进行调整，本实施例的光学三维成像系统还包括第一反射镜m1和第二反射镜m2。第一反射镜设置于物镜500和筒镜600之间。第二反射镜m2设置于第二数字微镜器件d2与分光器700之间。第一反射镜m1将经过物镜500的光束反射至筒镜600上。第二反射镜m2将经过第二数字微镜器件d2的光束反射至分光器700上。
光学衍射层析系统中的高数值孔径物镜决定了成像系统焦深很小，利托夫近似算法对于距离样品聚焦面较远的层面不成立，即无法一次性对较厚样品的光学衍射层析成像。为了解决较厚样品的三维成像，作为本发明的一种实施方式，轴向扫描器900中的第十透镜930设置为变焦透镜。作为本发明的一种实施方式，变焦透镜内部填充了液体，可通过改变电流来控制变焦透镜的焦距。
图2是根据本发明的实施例的样品的侧视图。
在本发明的实施例的光学三维成像系统中，当对变焦透镜施加不同的电流时，图像获取装置a与待测样品s的不同截面层共轭。分别获取在不同的焦距下，待测样品s的轴向上的不同角度照明光下的干涉光场图。例如，假设将变焦透镜设置3个不同的焦距，对应第一焦距、第二焦距和第三焦距。参照图2所示，图2示出了样品s的一种示例性情况，样品s轴向上包括第一焦距对应的第一焦平面e1、第二焦距对应的第二焦平面e2和第三焦距对应的第三焦平面e3。第一焦平面e1对应的合成景深范围为f1、第二焦平面e2对应的合成景深范围为f2，第三焦平面e3对应的合成景深范围为f3。当在变焦透镜上施加第一电流时，物面上第一焦平面e1将于图像获取装置a共轭，此时使用前述系统扫描照明待测样品s，获得不同角度照明光下的第一焦平面e1对应的第一合成景深范围f1内的第一干涉光场图，进一步采用基于利托夫近似的光学衍射重建算法，获得第一焦平面e1对应的第一合成景深范围f1内的第一三维折射率分布。类似地，改变施加电流，即可获得第二电流下的第二焦平面e2对应的第二合成景深范围f2内的第二三维折射率分布以及获得第三电流下的第三焦平面e3对应的第三合成景深范围f3内的第三三维折射率分布。具体地，第一合成景深范围、第二合成景深范围与第三合成景深范围所覆盖的检测范围将待测样品s完全覆盖。最后采用相关缝合算法，将第一三维折射率分布、第二三维折射率分布及第三三维折射率分布合成得到待测样品s轴向分辨率一致的三维折射率图，实现折射率高精度重建。
通过可调焦的轴向扫描器对待测样品进行轴向扫描，可以获取厚样品的轴向上分辨率一致的多个合成景深范围内的三维折射率图，实现折射率高精度重建。
下面根据具体的实施方式对本发明的实施例的光学三维成像系统进行具体阐述。
采用633nm波长的氦氖激光作为激光光源100，经过第一空间滤波器200的第一光阑230滤波得到均匀的平行光。第一透镜210和第二透镜220焦距均为75mm，200um的第一光阑230用来过滤掉高斯光束的噪声，第一光阑230放置在第一透镜210的后焦平面和第二透镜220的前焦平面处。入射激光照射到加载有lee型的全息图序列的第一数字微镜器件d1上产生多级衍射光，通过第一数字微镜器件d1上加载的一系列数值计算的lee型全息图序列控制第一数字微镜器件d1上对应的微镜得到环形扫描衍射光。
第一数字微镜器件d1放置在第三透镜310的前焦平面处。在第三透镜310的后焦平面和第四透镜320的前焦平面重合处放置有一个第二光阑330。第二光阑330的环形和中间小孔用于选择+1级衍射光。环形的半径由lee全息图所决定，例如内圆半径可设置为1.2mm，环宽与小孔直径均为0.6mm。第三透镜310和第四透镜320焦距均为150mm。
环形扫描衍射光经过第四透镜320准直后，由第五透镜410与聚光镜420实现照明角度的放大。第五透镜410焦距为150mm，聚光镜420采用放大倍数为60x、na＝0.7的消色差物镜。第五透镜410放置在第四透镜320的后焦平面处，第五透镜410的后焦平面与聚光镜420的前焦平面重合。扫描光照射到样品s后经过物镜500和筒镜600成像，物镜500采用放大倍数为60x、na＝0.7的消色差物镜。经过筒镜600的像面散射光进一步照射到分光器700，分光器700采用光栅，光栅参数为70槽/毫米。
筒镜600与光栅之间放置有第二数字微镜器件d2，第二数字微镜器件d2和数字微镜器件d1同步，用来保持像面散射光方向不变。经光栅衍射后的衍射光照射到第三空间滤波器800上，光栅放置在第六透镜810的前焦平面处，第六透镜810后焦平面和第七透镜820的前焦平面重合。第六透镜焦距为40mm，第七透镜焦距为300mm。在第六透镜后焦平面和第七透镜的前焦平面重合处放置有第三光阑830，第三光阑包括中心的小圆孔以及小圆孔附近的大圆孔。小圆孔与大圆孔分别只让+1级光和0级光通过。+1级衍射光经过小孔滤波后作为参考光，0级衍射光完全通过大孔后作为信号光。小圆孔的直径为25μm，大圆孔设置于距离小圆孔2mm处，大圆孔的直径为1mm。
在第七透镜和图像获取装置a之间放置有一个轴向扫描器900。轴向扫描器900包括第八透镜910、第九透镜920以及第十透镜930。第八透镜910的后焦平面和第九透镜920的前焦平面处重合处放置有一个第十透镜930。第八透镜910的焦距为200mm，第九透镜的焦距为150mm。通过改变电流控制第十透镜的焦距，使图像获取装置a与待测样品s的不同截面层共轭。
实施例二
图2是根据本发明的实施例二的光学三维成像方法的流程示意图。
参照图2所示，本发明的第二实施例还提供了一种如上所述的光学三维系统的光学三维成像方法，所述方法包括步骤：
s100、将所述第十透镜930的焦距设置为多个；
具体地，作为本发明的一种实施方式，第十透镜930为变焦透镜，对第十透镜施加不同的电流，可以将第十透镜930设置为不同的焦距。每个焦距下，图像获取装置a与待测样品的不同截面层共轭。例如将第十透镜930的焦距设置为三个，即第一焦距、第二焦距和第三焦距。第十透镜930设置为第一焦距时，对应物面上的第一焦平面e1与图像获取装置a共轭。同样地，第十透镜930设置为第二焦距时，对应物面上的第二焦平面e2与图像获取装置a共轭。第十透镜930设置为第三焦距时，对应物面上的第三焦平面e3与图像获取装置a共轭。可以理解的是，这里仅作示例性的说明，具体焦距数量的设置要根据实际样品的厚度进行设置，本发明对此不作限制。
s200、所述图像获取装置a分别获取所述第十透镜930在每个焦距下的待测样品s的局部的三维折射率分布图；
具体地，在每个焦距下，可以获得对应的合成景深范围内的干涉光场图，再基于光学衍射重建算法获得三维折射率分布。例如：在第一焦距下，可以获得第一焦平面e1对应的第一合成景深范围f1内的第一干涉光场图，再基于光学衍射重建算法获得第一三维折射率分布；同理，在第二焦距下，可以获得第二焦平面e2对应的第二合成景深范围f2内的第二干涉光场图并进一步获得第二三维折射率分布；在第三焦距下，可以获得第三焦平面e3对应的合成景深范围f3内的第三干涉光场图并进一步获得第三三维折射率分布。可以理解的是，第一景深范围、第二景深范围与第三景深范围所覆盖的检测范围将待测样品s完全覆盖。
s300、将所有局部三维折射率分布图采用缝合算法合成完整的三维折射率分布图。
最后采用缝合算法，将所有局部三维折射率分布图采用缝合算法合成完整的三维折射率分布图，得到待测样品s轴向分辨率一致的三维折射率图，实现折射率高精度重建。
本发明通过数字微镜器件代替现有的扫描振镜进行环形扫描照明，可提高成像速度和稳定性，降低附加像差，大大提高时空稳定性。本发明加入轴向扫描模块，提升轴向折射率精度一致性，最大程度减小了三维重建折射率图的误差。
虽然已经参照特定实施例示出并描述了本发明，但是本领域的技术人员将理解：在不脱离由权利要求及其等同物限定的本发明的精神和范围的情况下，可在此进行形式和细节上的各种变化。