双花草珊瑚含片HPLC特征图谱的构建方法及其HPLC特征图谱与流程

本发明涉及中成药的质量检测技术领域，具体涉及一种复方中成药双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法及其hplc特征图谱，以及该hplc特征图谱在双花草珊瑚含片药品质量标准与质量控制中的应用。

背景技术

双花草珊瑚含片是一种复方中成药，由肿节风、金银花、薄荷脑组成，具有疏风解热，利咽止痛的功效，用于改善咽喉干灼，疼痛，声音嘶哑等症。药品收载于国家食品药品监督管理局《国家药品标准》ws-5402(b-0402)-2012z，药品标准中仅有3个化学成分的定性鉴别和1个含量测定。由于中成药成分复杂，单一的指标难以全面控制产品的质量，中成药是一个多组分、多靶点的体系，强调的是整体性，因此建立全面反映主要成分的特征图谱，能够较全面的反映出中成药的内在质量，从整体性综合控制与评价中成药。中药特征图谱是中成药中所共有的具有特征性的某一类成分的色谱或光谱图谱，具有整体性、模糊性和可量化性，作为一种有效的质量控制模式，其专属性与特征性强，目前已成为中成药质量控制与评价的有效方法，得到行业的认可。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法及其hplc特征图谱，以及该hplc特征图谱在双花草珊瑚含片药品质量标准与质量控制中的应用，该方法采用高效液相色谱(hplc)建立其特征图谱，并用相似度软件进行评价，可全面地对双花草珊瑚含片的质量进行评价，保证药品质量的均一性、稳定性及临床用药的有效性与安全性。

其具体的技术方案如下：

一种双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法，该方法包括以下所述的步骤和条件：

（1）以绿原酸为特征图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰；

（2）供试品溶液的制备：取双花草珊瑚含片，研细，取4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇25ml，称定重量，在超声功率为250w、超声波频率为40khz的条件下进行超声处理30分钟，取出，称定重量，用体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（3）参照物溶液与对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含绿原酸0.03～0.05mg的溶液，即得参照物溶液；取异嗪皮啶对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含异嗪皮啶0.01～0.03mg的溶液，即得对照品溶液；

（4）高效液相色谱分析

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱的规格是5μm，4.6mm×250mm；以乙腈为流动相a，以体积百分含量为0.2%的磷酸溶液为流动相b，采用以下梯度洗脱的方式进行梯度洗脱：从0～10mim，流动相a的体积百分含量为10％，流动相b的体积百分含量为90％；从10～30mim，流动相a的体积百分含量由10％提高至20％，流动相b的体积百分含量由90％降低至80％；从30～50mim，流动相a的体积百分含量为20％，流动相b的体积百分含量为80％；从50～60mim，流动相a的体积百分含量由20％降低至10％，流动相b的体积百分含量由80％提高至90％；检测波长为335nm；柱温为25℃；流速为1ml/分钟，理论板数按绿原酸峰计算不低于7000；

（5）测定：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录50分钟色谱图，测定10批双花草珊瑚含片供试品的特征图谱，得到由其共有特征峰构成的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱。

上述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法，该方法还包括以下步骤：

（6）精密度试验：取同一批双花草珊瑚含片供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，仪器稳定，精密度良好；

（7）稳定性试验：取同一批双花草珊瑚含片供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，供试品溶液在24小时内稳定；

（8）重复性试验：取同一批双花草珊瑚含片，分别取6份，按供试品溶液的制备方法和上述色谱条件，分别检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，所述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法重复性良好。

本发明的另一目的是提供上述双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法构建得到的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱，所述的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱是由13个共有峰构成，以对照品对照，4号峰为绿原酸、7号峰为异嗪皮啶，以绿原酸为参照物，4号峰（s）为参照峰，该标准对照特征图谱具有13个共有特征峰，以参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±5%之内，规定值为峰1：0.279，峰2：0.351，峰3：0.557，峰s：1.000，峰5：1.129，峰6：1.425，峰7：2.556，峰8：2.742，峰9：2.909，峰10：3.017，峰11：3.172，峰12：3.509,峰13：3.667。

上述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法，构建得到的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱在双花草珊瑚含片药品质量标准与质量控制中的应用；采用该构建得到的hplc标准对照特征图谱对双花草珊瑚含片进行检测，按照上述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法中所述的步骤和条件，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录50分钟色谱图，供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，以参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱规定值的±5%之内。

本发明具有如下优点和用途：本发明通过高效液相色谱(hplc)建立双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱，并通过试验确定标准对照特征图谱的精密度、重现性及稳定性；通过检测双花草珊瑚含片的hplc特征图谱，可较全面地对中成药双花草珊瑚含片的内在质量进行控制与评价，保证药品质量的稳定性与一致性，以及临床用药的有效性与安全性。本发明建立得到的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱，可用于双花草珊瑚含片的药品质量标准与质量控制。

下面结合附图与具体实施方式，对本发明进一步详细说明。

附图说明

图1是双花草珊瑚含片的hplc-dad三维图；

图2是双花草珊瑚含片220nm特征图谱；

图3是双花草珊瑚含片254nm特征图谱；

图4是双花草珊瑚含片335nm特征图谱；

图5是双花草珊瑚含片360nm特征图谱；

图6是双花草珊瑚含片精密度试验指纹图谱；

图7是双花草珊瑚含片稳定性试验指纹图谱；

图8是双花草珊瑚含片重复性试验指纹图谱；

图9是阴性样品的hplc色谱图；

图10是体积浓度为50%的甲醇的hplc色谱图；

图11是异嗪皮啶对照品的hplc色图谱；

图12是绿原酸对照品的hplc色图谱；

图13是双花草珊瑚含片hplc特征图谱；

图14是双花草珊瑚含片2h的hplc特征图谱；

图15是金银花药材的hplc特征图谱；

图16是肿节风药材的hplc特征图谱；

图17是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170801）；

图18是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170802）；

图19是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170803）；

图20是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170804）；

图21是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170805）；

图22是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170806）；

图23是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170807）；

图24是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170808）；

图25是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170809）；

图26是双花草珊瑚含片hplc特征图谱（批号170811）；

图27是10批双花草珊瑚含片的hplc特征图谱；

图28是双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱，图中，峰s：绿原酸，峰7：异嗪皮啶。

具体实施方式

实施例1

一种双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法，该方法包括以下所述的步骤和条件：

（1）以绿原酸为特征图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰；

（2）供试品溶液的制备：取双花草珊瑚含片，研细，取4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇25ml，称定重量，在超声功率为250w、超声波频率为40khz的条件下进行超声处理30分钟，取出，称定重量，用体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（3）参照物溶液与对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含绿原酸0.03～0.05mg的溶液，即得参照物溶液；取异嗪皮啶对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含异嗪皮啶0.01～0.03mg的溶液，即得对照品溶液；

（4）高效液相色谱分析

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；色谱柱的规格是5μm，4.6mm×250mm；以乙腈为流动相a，以体积百分含量为0.2%的磷酸溶液为流动相b，采用以下梯度洗脱的方式进行梯度洗脱：从0～10mim，流动相a的体积百分含量为10％，流动相b的体积百分含量为90％；从10～30mim，流动相a的体积百分含量由10％提高至20％，流动相b的体积百分含量由90％降低至80％；从30～50mim，流动相a的体积百分含量为20％，流动相b的体积百分含量为80％；从50～60mim，流动相a的体积百分含量由20％降低至10％，流动相b的体积百分含量由80％提高至90％；检测波长为335nm；柱温为25℃；流速为1ml/分钟，理论板数按绿原酸峰计算不低于7000；

（5）测定：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录50分钟色谱图，测定10批双花草珊瑚含片供试品的特征图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱；该双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱是由13个共有峰构成，以对照品对照，4号峰为绿原酸、7号峰为异嗪皮啶，以绿原酸为参照物，4号峰（s）为参照峰，该标准对照特征图谱具有13个共有特征峰，以参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间在规定值的±5%之内，规定值为峰1：0.279，峰2：0.351，峰3：0.557，峰s：1.000，峰5：1.129，峰6：1.425，峰7：2.556，峰8：2.742，峰9：2.909，峰10：3.017，峰11：3.172，峰12：3.509,峰13：3.667；

（6）精密度试验：取同一批双花草珊瑚含片供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，仪器稳定，精密度良好；

（7）稳定性试验：取同一批双花草珊瑚含片供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，供试品溶液在24小时内稳定；

（8）重复性试验：取同一批双花草珊瑚含片，分别取6份，按供试品溶液的制备方法和上述色谱条件，分别检测特征图谱，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，所述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法重复性良好。

上述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法，构建得到的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱在双花草珊瑚含片药品质量标准与质量控制中的应用；采用该构建得到的hplc标准对照特征图谱对双花草珊瑚含片进行检测，按照上述的双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法中所述的步骤和条件，分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录50分钟色谱图，供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，以参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱规定值的±5%之内。

实施例2

一种双花草珊瑚含片hplc特征图谱的构建方法，具体实验步骤如下：

仪器、试剂与试药

仪器：美国agilent1260高效液相色谱仪（四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、dad检测器、openlab色谱工作站）；xs205分析天平（德国）；超声波清洗器kq5200b（昆山市超声仪器有限公司）；gm-0.33a隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）。

试剂试药：绿原酸对照品（批号：绿原酸：110753-201314，中国食品药品检定研究院）；异嗪皮啶对照品（批号：110837-201608，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其它试剂为分析纯。

药品：双花草珊瑚含片（广西昌弘制药有限公司，批号：170801、170802、170803、170804、170805、170806、170807、170808、170809、170811）；肿节风药材（广西昌弘制药有限公司）；金银花药材（广西昌弘制药有限公司）；薄荷脑（广西昌弘制药有限公司）。

分析软件：中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004a版（国家药典委员会）。

1双花草珊瑚含片特征图谱试验条件选择

1.1流动相选择

通过试验并参考有关文献，选择乙腈为主要流动相，实验考察了乙腈-0.2%磷酸系统以及不同的梯度洗脱效果（表1），最终确定梯度洗脱程序，如表2所示。

1.2波长选择

实验采用dad检测器考察了200～400nm范围的检测情况（图1），重点考察220nm、254nm、335nm、370nm4个波长(图2-图5)。在220nm时大极性未知成分响应较强，绿原酸峰响应值低；在254nm及370nm时，大部分成分峰面积小，响应值低；在335nm处色谱信息丰富，各成分均有较好吸收，响应值适中，各峰分离度较好，基线平稳，且绿原酸及异嗪皮啶的最大吸收波长均接近335nm，故选择335nm作为检测波长。

1.3色谱柱柱温选择

实验考察了柱温在20℃、25℃、30℃下色谱峰的分离效果。各色谱峰分离较好，峰形较对称，鉴于20℃较难控制，30℃不利于色谱柱使用寿命，故选择柱温为25℃。

1.4提取溶剂选择

实验比较了乙醇、50%甲醇、甲醇各项提取溶剂超声提取的高效液相色谱图差异。乙醇未提取出各类成分，50%甲醇、甲醇所提出的成分相差不大，而50%甲醇所提取绿原酸含量最高，故在此选择50%甲醇作为提取溶剂。

1.5提取时间考察

实验比较了50%甲醇超声提取10min、30min、60min的提取效率，超声10min图谱重复性不佳，超声30min便能将各成分提取较完全，故选取超声30min对样品进行提取。

2双花草珊瑚含片特征图谱的建立

2.1参照物溶液的制备

精密称取绿原酸对照品适量，置于25ml容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。绿原酸：0.035mg/ml。

2.2异嗪皮啶对照品溶液的制备

精密称取异嗪皮啶对照品适量，置于25ml容量瓶中，加50%甲醇溶解至刻度，摇匀，即得。异嗪皮啶：0.019mg/ml。

2.3供试品溶液的制备

取片重差异下的本品，研细，取约4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇25ml，称定重量，超声处理（250w，40khz）30分钟，取出，称定重量，用体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4金银花药材溶液制备

金银花药材粉碎，取5g，置不锈钢锅中，加入20倍量水煎煮2次，第一次煎煮2h，第二次煎煮1h，合并煎液，滤过，浓缩至约100ml备用。精密吸取浓缩液1ml至100ml容量瓶，加体积浓度为50%的甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.5肿节风药材溶液制备

肿节风药材粉碎，取10g，置不锈钢锅中，加入20倍量水煎煮2次，第一次煎煮2h，第二次煎煮1h，合并煎液，滤过，浓缩至约50ml备用。精密吸取浓缩液5ml至10ml容量瓶，加体积浓度为50%的甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.6色谱条件与系统适应性试验

色谱柱：agilentzorbaxsb-c18柱（5μm，4.6×250mm）；流动相：乙腈(a)-0.2%磷酸(b)，a：0～10min10%，10～30min10%～20%，30～50min20%；流速：1.0ml/min；检测波长：335nm；柱温：25℃；进样量：10μl；分析时间：50min。

理论塔板数（表3）

最终确定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以体积百分含量为0.2%的磷酸溶液为流动相b，按表4中的规定进行梯度洗脱；检测波长为：335nm；柱温为25℃。理论板数按绿原酸峰计算应不低于7000。

参照物溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取双花草珊瑚含片，研细，取约4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇25ml，称定重量，超声处理（250w，40khz）30分钟，取出，称定重量，用体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录50分钟色谱图，即得。

2.7方法学考察

2.7.1精密度试验

取同一批双花草珊瑚含片（批号170804）供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，检测特征图谱，如图6，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，仪器稳定，精密度良好，结果见表5-1至表5-3。

2.7.2稳定性试验

取同一批双花草珊瑚含片（批号170804）供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，检测特征图谱，如图7，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，供试品溶液在24小时内稳定。提示供试品稳定性良好，结果见表6-1至表6-3。

2.7.3重复性试验

取双花草珊瑚含片（批号170804）20片，研细，取约4.0g，按“2.3供试品溶液的制备”项下方法分别制备6份，在上述色谱条件下依次进样，分别检测特征图谱，如图8，记录各共有峰保留时间及峰面积，以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，各共有峰相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0%，用相似度评价软件计算各色谱峰特征图谱的相似度均大于0.99，提示该实验方法重复性良好，结果见表7。

2.7.3阴性干扰试验

阴性样品制备：按处方工艺制备缺少肿节风及金银花药材的阴性含片，按供试品制备方法制备阴性样品。溶剂：体积浓度为50%的甲醇。

分别精密吸取阴性样品溶液及体积浓度为50%的甲醇各10μl，按特征图谱色谱分析条件，注入液相色谱仪分析，记录色谱图，如图9-图10。结果显示阴性样品与溶剂均无色谱干扰，阴性样品及样品溶剂对特征图谱色谱分析均无干扰，方法专属性良好。

2.8特征指纹图谱的建立

按上述色谱条件记录10批双花草珊瑚含片供试品的特征图谱，确定13个共有峰构成其特征图谱。采用对照品确认已知成分s(4)号峰为绿原酸、7号峰为异嗪皮啶（图11），其他共有峰为未知成分。双花草珊瑚含片中绿原酸为主要成分之一，其分离度好，出峰时间适中，峰面积较大且稳定，故选择绿原酸作为参照峰，标记为s（见图12、图13）。在相同色谱条件下对金银花药材（图15）和肿节风药材（图16）进行药材色谱指纹图谱分析，由药材色谱指纹图谱11、12以及文献得知，绿原酸分别来源于金银花和肿节风两种药材，异嗪皮啶来源于肿节风药材，其他未知成分共有峰分别来源于不同的药材。

记录2小时双花草珊瑚含片特征色谱图，从2h特征图谱（图14）可见，50min后无有意义的色谱峰出现，故确定特征图谱记录时间为60min。记录特征图谱见图13。以4号峰绿原酸色谱峰（s峰）的保留时间和峰面积为1，计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积值，共有指纹峰特征参数见表8。

2.9双花草珊瑚含片与单味药材特征图谱对比

从图中可以看出，除2号峰外，制剂中的共有峰均能在处方中的药材中找到相对应的指纹特征峰，峰1、3、s、5、6、8、10、11、12来自金银花药材，峰1、3、s、5、6、7、9、13来自肿节风药材，s峰绿原酸为两种药材共有，与文献报道相符，7号峰是肿节风特有为异嗪皮啶，峰10、11、12为金银花特有，峰7、9、13为肿节风特有。2号峰未能找到相应的药材归属，但在10批制剂样品中均出现，在少数批次制剂中2号峰峰面积有较大差异，可能为制剂生产过程中产生的成分。结果表明，在生产制剂过程中基本保留了原药材的成分特征。

2.10结果

2.10.1不同批号样品特征图谱比较

取10个不同批号的双花草珊瑚含片，分别按“2.3供试品溶液的制备”项下方法制备，进样，检测特征图谱（见图17-图26），以绿原酸色谱峰的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，见表9。

比较10批供试品色谱图，各批次双花草珊瑚含片的13个共有指纹特征峰峰面积之和均占其总峰面积的90%以上，见表10。

2.10.2相似度评价

将在拟定色谱条件下记录的10批制剂色谱图转换成数值数据导出后，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件2004版（国家药典委员会）进行数据导入、匹配、校正（图27），生成能够综合反映所有样品指纹特征信息的对照特征图谱即双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱（图28）。通过与对照特征图谱比较，计算各批次制剂相似度，见表11。

本实验对双花草珊瑚含片进行了特征图谱研究，并采用相似度软件对色谱峰数据进行评价，建立了双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱，结果表明，各批次制剂峰群的整体图貌基本一致，确定了13个共有峰，相似度均在0.9以上。

2.10.3相对保留时间规定值

取10批号的特征图谱，以绿原酸色谱峰的保留时间为参照，计算各共有峰相对保留时间及平均值，计算结果10批次各共有峰的相对保留时间与平均值的偏差在0.5%以内，见表12。

根据以上结果，确定相对保留时间规定值：

规定值为0.279（峰1），0.351（峰2），0.557（峰3），1.000（峰s），1.129（峰5），1.425（峰6），2.556（峰7），2.742（峰8），2.909（峰9），3.017（峰10），3.172（峰11），3.509（峰12）,3.667（峰13）。其相对保留时间应在规定值的±5%之内。

3结论

实验以绿原酸峰为参照，通过方法学研究以及10批样品测定，建立双花草珊瑚含片的特征图谱，即由13个共有峰构成的双花草珊瑚含片的hplc标准对照特征图谱（图28），其中s峰为绿原酸，7号峰为异嗪皮啶，试验证明特征图谱特征性与专属性强，方法可行，可用于产品的质量控制，从而建立提升制剂的质量控制标准，为药品标准提升与规范化生产提供理论依据与技术保障。

制定双花草珊瑚含片的特征图谱如下：

【特征图谱】双花草珊瑚含片照高效液相色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0512）测定。

（1）以绿原酸为特征图谱参照物，以绿原酸色谱峰为参照物峰；

（2）供试品溶液的制备：取双花草珊瑚含片片重差异下的本品，研细，取4.0g，精密称定，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入体积浓度为50%的甲醇25ml，称定重量，在超声功率为250w、超声波频率为40khz的条件下进行超声处理30分钟，取出，称定重量，用体积浓度为50%的甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

（3）参照物溶液与对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含绿原酸0.03～0.05mg的溶液，即得参照物溶液；取异嗪皮啶对照品适量，精密称定，加体积浓度为50%的甲醇制成每1ml含异嗪皮啶0.01～0.03mg的溶液，即得对照品溶液；

（4）高效液相色谱分析

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2%磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为：335nm；柱温为25℃，流速为1ml/分钟，理论板数按绿原酸峰计算应不低于7000；

（5）测定法:分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录50分钟色谱图，即得。

供试品特征图谱中应呈现13个特征峰，以参照物峰相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为0.279（峰1），0.351（峰2），0.557（峰3），1.000（峰s），1.129（峰5），1.425（峰6），2.556（峰7），2.742（峰8），2.909（峰9），3.017（峰10），3.172（峰11），3.509（峰12）,3.667（峰13）。