一种蛋白质包裹的荧光金纳米簇、制备方法及其应用与流程

本发明属于金纳米簇、制备方法及其应用，特别属于蛋白质包裹的荧光金纳米簇、制备方法及其应用这一技术领域。

背景技术

金纳米簇一般是由几十至几百个金原子组成的，尺寸在2nm以内。金纳米簇物理化学性质依赖于纳米簇的粒径尺寸，随着金纳米簇原子数目和大小的改变，其荧光发射波长随之在紫外(uv)到近红外光(ir)区范围内变化。金纳米簇具有稳定性好、光致荧光性、光稳定性、荧光发射率强、生物相容性好等独特的优点，成为纳米材料领域中发展前景最好的材料之一，被广泛应用于金属离子与小分子的检测、生物标记、细胞成像、酶催化及药物传递等领域。常用的金纳米簇的制备方法是利用硫醇化合物作为保护剂、硼氢化钠为还原剂，通过还原金的前驱体制备，上述制备方法反应条件复杂。

技术实现要素：

本发明所要解决的第1个技术问题是提供一种新的荧光金纳米簇。

本发明解决的第2个技术问题是提供一种工艺简单的金纳米簇的制备方法。

本发明解决的第3个技术问题是上述金纳米簇的应用。

本发明解决技术问题的技术方案为：一种蛋白质包裹的荧光金纳米簇，所述的金纳米簇为抑肽酶包裹的金纳米簇，所述的金纳米簇由抑肽酶分子和au22或au21或au16构成。

本发明的制备方法为：将haucl4溶液加入到抑肽酶溶液中，涡旋器充分混匀5-10min；再加入naoh溶液，调节溶液ph值为11-13，涡旋器混匀5-10min；将合成的溶液在密闭、避光的条件下于37℃90rpm摇床震荡10-16h，将产物置于1000da的透析袋中透析24-48h，随后4℃下避光保存，抑肽酶与haucl4的摩尔比为1:(1.5–3)。

所述的抑肽酶购买自上海生物工程有限公司，其cas号为9087-70-1。

所述的荧光金纳米簇在cu²⁺检测中的应用，铜离子的线性范围为200μm-3300μm(r²＝0.986)，其检测限为126.99μm。

所述的荧光金纳米簇在hg²⁺检测中的应用，汞离子的线性范围为0μm-330μm(r²＝0.983)，其检测限为19.43μm。

所述荧光金纳米簇在胰蛋白酶检测中的应用，胰蛋白酶的线性范围为25μg/ml-100μg/ml，其检测限为8.95μg/ml。

所述荧光金纳米簇在生物荧光成像探针的应用。ap-aunc不仅具有良好的细胞相容性，还可进入细胞内，应用于生物荧光成像探针方面的研究。

抑肽酶(aprotinin,ap)，也称为胰蛋白酶抑制剂(trypsininhibitor,ti)，是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，存在于动物器脏、男性尿液及一些植物中。抑肽酶是由58个氨基酸残基组成的单链碱性蛋白，其相对分子量为6.51kda，链内有3个二硫键相互交联，等电点为10.5，具有三个二硫键，其活性成环部位含有一个赖氨酸和一个丙氨酸(也称为kunitz域)，赖氨酸和丙氨酸与丝氨酸蛋白酶的丝氨酸部位紧密结合后，从而抑制蛋白酶的活性。抑肽酶具有广泛的生物学活性，对外科手术后出血与止血、急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克、体外循环引起的炎性反应以及抑制肿瘤侵袭有独特的疗效。

抑肽酶作为模板合成金纳米簇ap-auncs，整个合成过程简单、绿色、高效。抑肽酶在合成中既作为保护剂又作为还原剂，半胱氨酸巯基捕捉金属原子，酪氨酸还原金属。首先蛋白上的半胱氨酸的巯基(-sh)结合形成au-s键并且固定在蛋白质上，然后酪氨酸将au(iii)还原成为au(i)及零价的金原子au(0)，最后抑肽酶独特的稳定的三维立体结构的保护，合成的金纳米簇十分稳定。

本发明与现在技术相比，所合成的荧光金纳米簇ap-auncs，最大发射光谱为550nm，最大激发光谱为640nm，不但具有荧光性，而且抑肽酶本身的活力并未受到影响，可以应用于金属离子的检测，生物成像，蛋白酶检测，细胞成像领域。传统的生物分子ap功能单一，体内分布无法追踪，本发明合成具有红色荧光的ap包裹的auncs，其不仅保留了原始ap相应的生物学活性，同时具备荧光追踪生物分子ap的分布的能力。同时由于纳米金簇具备多种良好的生物相容性和检测功能和治疗潜力，在金属离子的检测，生物成像，治疗领域具有重要的意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1所制的ap-auncs的高分辨率透射电镜图。

图2为实施例1所制的ap-auncs的粒径分布图。

图3为实施例1所制的ap-auncs的xps能谱图。

图4为实施例1所制的ap-auncs的maldi-tof质谱图。

图5为实施例1所制的ap-auncs和ap的紫外-可见吸收光谱图。

图6为实施例1所制的ap-auncs的荧光光谱图，左为激发光谱(λex＝550nm)，右为发射光谱(λem＝640nm)

图7为抑肽酶ap与实施例1所制的金纳米簇ap-auncs的酶活检测图。

图8为实施例1所制的ap-auncs应用于金属离子检测的柱状图。

图9为实施例1所制的ap-auncs应用于hg²⁺检测的荧光光谱图。

图10为实施例1所制ap-auncs的应用于hg²⁺检测的线性关系图。

图11为实施例1所制的ap-auncs应用于cu²⁺检测的荧光光谱图。

图12为实施例1所制ap-auncs的应用于cu²⁺检测的线性关系图。

图13为实施例1所制的ap-auncs应用于蛋白酶检测的柱状图。

图14为实施例1所制的ap-auncs应用于胰蛋白酶检测的荧光光谱图。

图15为实施例1所制ap-auncs的应用于胰蛋白酶检测的线性关系图。

图16实施例1所制ap-auncs对细胞毒性检测的mtt图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明。

实施例1：

取0.1ml的25mm的haucl4加入到2.36ml体积0.53mm的抑肽酶溶液中，涡旋器充分混匀5min；随后向管内加入0.08ml1.0m的naoh溶液，涡旋器迅速混匀，避免沉淀，混匀时间5min，制成合成的溶液；将合成的溶液密闭、避光的条件下，37℃90rpm摇床震荡12h。反应完毕后，样品置于1000da的透析袋中透析10h，随后4℃下避光保存待用，抑肽酶与haucl4的摩尔比为1：2。

实施例1所制的ap-auncs，其形貌如图1所示，呈大小均匀的球形；

如图2所示：对118个金纳米簇颗粒ap-auncs进行测量，并经过数据统计发现ap-auncs的粒径分布在2.25nm-3.25nm范围内，平均粒径为2.84±0.6nm。

如图3所示：所制的ap-auncs的xps能谱表明au4f5/2andau4f7/2的绑定能是87.6evand84.0ev。对应au的氧化状态为一价和零价。

如图4所示：飞行时间质谱表明一系列致密的峰在2.5-5.5km/z出现，结合荧光光谱，所制的抑肽酶包裹的金纳米簇ap-auncs为由抑肽酶分子和au22或au21或au16构成的复合物。

实施例2：

取0.1ml的25mm的haucl4加入到1.57ml体积0.53mm的抑肽酶溶液中，涡旋器充分混匀8min；随后向管内加入0.06ml1.0m的naoh溶液，涡旋器迅速混匀，避免沉淀，混匀时间8min；将合成的溶液密闭、避光的条件下，37℃90rpm摇床震荡12h。反应完毕后，样品置于1000da的透析袋中透析36h，随后4℃下避光保存待用。抑肽酶与haucl4的摩尔比为1：3。

实施例3：

取0.1ml的25mm的haucl4加入到3.14ml体积0.53mm的抑肽酶溶液中，涡旋器充分混匀10min；随后向管内加入0.1ml1.0m的naoh溶液，涡旋器迅速混匀，避免沉淀，混匀时间10min；将合成的溶液密闭、避光的条件下，37℃90rpm摇床震荡24h。反应完毕后，样品置于1000da的透析袋中透析16h，随后4℃下避光保存待用，抑肽酶与haucl4的摩尔比为1：1.5。

实施例4：

ap、ap-auncs紫外光谱的表征

分别取ap、实施例1所制的ap-auncs放入比色皿中，使用紫外分光光度仪uv-1700检测测紫外光谱，结果表明ap在280nm处有紫外吸收，而实施例1所制的ap-auncs在此处没有最大吸收，且在350-800nm范围具有较宽的吸收谱(图5)，证明实施例1所制的ap-auncs和抑肽酶本身不是同一种物质。

实施例5：

ap-auncs荧光光谱的表征

分别取ap及实施例1所制的ap-auncs置于ep管中，采用暗箱式四用紫外分析仪，观察它们的的荧光特性，结果表明在365nm紫外灯照射下实施例1所制的ap-auncs溶液发射出强烈的红色荧光，可见光下ap-auncs溶液为无色，而抑肽酶在紫外光及可见光下均为无色。取实施例1所制的ap-auncs放入比色皿中，使用rf-5301荧光分光光度计测量ap-auncs的最大激发光谱和最大发射光谱，结果表明该物质最大激发光谱和最大发射分别为550nm和640nm(图6)。

实施例6

实施例1所制的ap-auncs与ap酶活检测

酶活检测标准体系200μl，15μl1.0mm的banpa，20μl8mg/ml的胰蛋白酶，不同终浓度的ap或ap-auncs(0,50,100,150,200,250and300μm)，10mmpbs(ph7.4)，反应温度为25℃，反应时间5min。使用可以自动控温的cary300uv分光光度计，检测波长为410nm。检测波长为od410。如图7所示，结果显示实施例1所制的ap-auncs与ap酶活无明显差别，表明实施例1所制的ap-auncs在具备荧光特性的基础上，仍具有原有的抑肽酶的活性，因而除抑肽酶原有的应用如应用于外科手术后止血、急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克、体外循环引起的炎性反应等方面，而且还可基于其荧光特性应用于体内追踪生物分子ap的分布的能力。

实施例7：

实施例1所制的ap-auncs应用于金属离子hg²⁺和cu²⁺的检测

使用rf-5301荧光分光光度计检测不同的金属阳离子对ap-auncs金纳米簇的荧光强度的影响。

检测标准体系200μl，130μl10mmpbs(ph7.4)，20μl20mm的金属离子，50μl0.53mm的ap-auncs。盐溶液与金纳米簇溶液混合，25℃水浴5min后，在激发光波长为550nm的条件下，检测溶液在640nm的发射光的峰高。所用12种阳离子分别为zn²⁺,na⁺,cr³⁺,ni²⁺,ca²⁺,fe²⁺,k⁺,hg²⁺,mg²⁺,cu²⁺,mn²⁺和al³⁺，结果显示hg²⁺和cu²⁺具有明显的荧光猝灭效应(图8)。

向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的汞离子溶液，结果显示，ap-auncs荧光猝灭程度随汞离子浓度的增大而增强(图9)，其相对荧光强度线性检测曲线为y＝1.03105+0.0011x，所构建的检测汞离子的线性范围为0μm-330μm(r²＝0.983)，其检测限为19.43μm(图10)。此研究结果表明，所制备的金纳米簇对hg²⁺离子具有高度选择性，因此本发明所制的金纳米簇荧光探针可用于分析检测实际样品中汞离子的含量，用于环境监测方面。

向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的铜离子溶液，结果显示，ap-auncs荧光猝灭程度随铜离子浓度的增大而增强(图11)，其相对荧光强度线性检测曲线为y＝1.18601+0.00011684x，所构建的检测铜离子的线性范围为200μm-3300μm(r²＝0.986)，其检测限为126.99μm(图12)。结果表明，实施例1所制的ap-auncs对cu²⁺离子具有高度选择性，因此本发明所制的金纳米簇荧光探针同样可用于分析检测实际样品中铜离子的含量，用于环境监测方面。

实施例8：

实施例1所制的ap-auncs应用于胰蛋白酶检测

使用rf-5301荧光分光光度计检测不同生物酶对实施例1所制的ap-auncs金纳米簇的荧光强度的影响。检测标准体系200μl，130μl10mmpbs(ph7.4)，20μl5mg/ml的蛋白酶，50μl0.53mm的ap-auncs。不同酶与金纳米簇溶液混合，37℃水浴2h后，在激发光波长为550nm的条件下，检测溶液在640nm的发射光的峰高。为研究金纳米簇对酶的选择性，所用8种酶分别为果胶酶(pectase)、蜗牛酶(snailase)、菠萝蛋白酶(bromelain)、胃蛋白酶(pepsin)、木瓜蛋白酶(papain)、溶菌酶(lysozyme)、胰蛋白酶(trypsase)、蛋白酶k(proteinasek)，结果如图13显示仅胰蛋白酶具有明显的荧光猝灭效应，其他酶对金纳米簇并没有明显的响应。

为进一步研究金纳米簇猝灭的响应速度和胰蛋白酶浓度之间的关系，向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的胰蛋白酶溶液，结果如图14显示，ap-auncs荧光猝灭程度随胰蛋白酶浓度的增大而增强，其线性检测曲线为y＝0.97486+0.00239，所构建的检测胰蛋白酶的线性范围为25μg/ml-100μg/ml，其检测限为8.95μg/ml(图15)。结果实施例1所制备的金纳米簇对胰蛋白酶的响应具有高度选择性，可用于分析检测细胞或其他样品中胰蛋白酶的含量、分布和迁移。

实施例9：

实施例1所制的ap-auncs对细胞活性的影响

ap-auncs的细胞毒性检测

采用mtt法对ap-auncs进行细胞毒性检测。将胰酶消化的hela细胞轻轻吹打为单细胞悬浮液，调整其浓度使细胞个数为5×10³个，将其加入到96孔板中，37℃、5％co2培养箱中培养24h，随后加入不同浓度的(0mm-500μm)ap-auncs继续培养24h，ph为7.4的pbs缓冲溶液洗涤3次，每孔再加入90μl的新鲜培养液和新配置的浓度为5mg/l的mtt溶液10μl，mtt溶液的终浓度为0.5mg/l，轻轻振动96孔板使其溶液混合均匀，放进培养箱继续培育4h，随后并弃去mtt和培养液的混合物，加入100μl二甲基亚枫(dmso)，黑暗条件下摇床震荡10min，使结晶物甲瓒充分溶解，tecanspark多功能酶标仪检测。

细跑存活率(％)＝(实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)*100％。由存活率来反映ap-auncs对hela细胞的毒性。

结果如图16显示随着ap-auncs(0μm、50μm、100μm、150μm、250μm、350μm、500μm)的浓度逐渐增加，hela细胞的活性并没有明显改变，在ap-auncs的使用浓度高达500μm时，hela细胞的成活率仍在95％以上，说明实施例1所制ap-aunc的细胞毒性低，生物相容性好。

实施例10

实施例1所制的ap-auncs在细胞成像中的应用

对ap-auncs在细胞体内靶向荧光成像进行研究。将胰酶消化的hela细胞轻轻吹打为单细胞悬浮液，随后接种于激光扫描共聚焦培养皿，37℃、5％co2培养箱中过夜培养。随后加入ap-auncs与hela细胞共培养3h，弃去培养基，pbs缓冲液洗涤3次，每次3min，以洗掉没有进入细胞内部和附着在细胞表面的金纳米簇，添加pbs缓冲液，并置于激光扫描共聚焦显微镜olympusfv1000下观察。当用568nm激发光激发样品时，可观察到加入实施例1所制ap-aunc孵化后的hela细胞质内有红色荧光。结果表明实施例1所制ap-aunc不仅具有良好的细胞相容性，还可跨过细胞膜进入细胞内，从而应用于生物荧光成像探针方面的研究。