本发明涉及分子免疫学
技术领域：
，具体涉及一种用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒及其应用。
背景技术：
：博卡病毒(humanbocavirus)是从小儿下呼吸道感染分泌物中分离到的一种新人细小病毒(parvovirus)。据报道瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院的tobiasallander儿童医院的医生在对540名儿童下呼吸道感染患者进行治疗时发现的。在这批儿童患者中，17名儿童体内存在这种新病毒，瑞典医生将之命名为“博卡病毒”。小儿下呼吸道感染可以由不同病毒引起，其中包括呼吸道合胞体病毒、流感病毒、腺病毒及冠状病毒。迄今为止，约10-39％的小儿下呼吸道感染的病因为未知。新分离的人博卡病毒被认为至少是引起5％比例的小儿下呼吸道感染的病因。据世界卫生组织统计，下呼吸道感染是全世界范围内造成五岁以下儿童死亡的主要疾病，患儿常表现出一般气喘病的症状。在美国，下呼吸道感染是小儿住院治疗的首要疾病，每年约有二百五十万病人。在中国，每年由于不明原因导致儿童住院治疗的人数也逐年上升。尽管病毒感染是小儿下呼吸道感染的重要原因，但在临床上，有相当比例的小儿下呼吸道感染病因不明。博卡病毒的发现无疑对小儿下呼吸道感染的病因研究和下呼吸道感染的诊治提供了新的科学依据。临床上对于感染性新发致病体快速、准确的检测是诊断和治疗的关键。人博卡病毒是2005年发现的一种感染儿童下呼吸道病毒，因此，针对该病毒的鉴定还没有一个快速、有效的方法。目前，对于人博卡病毒的检测和鉴定的报道只有xiaomingma等运用pcr技术检测318例临床样本，阳性检出率为5.7％。本课题组对人博卡病毒中的vp2基因进行成功表达，并将纯化的抗原结合westernblot和elisa技术，建立了该病毒的蛋白质水平检测体系，即人博卡病毒的分子免疫检测方法。目前，缺乏一种能够快速、准确、高效地检测出样品的用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒及其应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种能够快速、准确、高效地检测出样品的一种用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒及其应用。为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒，包括包被抗体、抗原、校准品、质控品、样品稀释液，所述包被抗体为单克隆抗体；所述抗原为人下呼吸道博卡病毒vp2融合蛋白；所述校准品为以prospec公司procalcitoninhumanrecombinant(hor-304，纯度≥97.0％)为参考物质制备50、100、200、400、800、3200pg/ml浓度的hbov阳性血清；所述质控品为由hbov临床检测高值人源样本配制而成，且经灭活处理，经检测其抗-tp、hbsag、抗-hcv和抗-hiv均为阴性；所述样品稀释液为检测样本的稀释液。进一步地，所述的单克隆抗体为抗人下呼吸道博卡病毒vp2融合蛋白的鼠源单克隆抗体；进一步地，所述人下呼吸道博卡病毒vp2融合蛋白为昆虫细胞sf9表达的融合蛋白。本发明所述的用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒在利用重组蛋白vp2可对下呼吸道样品中的博卡病毒抗体相应抗原进行检测中的应用。进一步地，所述的重组融合vp2在间接elisa技术的检测中的应用。进一步地，所述的重组融合vp2在临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查药物中的应用。有益效果：本发明具有使用简便、检测快速、灵敏、稳定、操作简便等优点，具有较高的灵敏度和特异性，抗干扰能力强。适用于广大中小医院使用。与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)采用检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定血清中人博卡病毒抗体水平，实现了检测的高灵敏度(低于50pg/ml)和特异性。(2)本发明一方面可以快速、准确地测定血清中人博卡病毒抗体的含量，对于炎症的早期诊断、早期治疗提供可靠的临床参考价值。(3)另一方面由于使用特异性的单克隆抗体作为包被固相，大大提高了人博卡病毒的检测灵敏度和特异性，抗干扰能力强。该相应的试剂盒，可以广泛用于临床疾病的诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与食品检疫、流行病学调查等方面。附图说明图1为本发明的sds-page分析了杆状病毒表达的人博卡病毒vp2蛋白；感染的昆虫细胞内高效表达了重组融合vp2蛋白，蛋白分子量60kda，目的蛋白表达量占昆虫可溶性蛋白80％以上；m：蛋白marker；1和2：ha标签vp2融合蛋白；3和4：表达vp2蛋白；5：昆虫细胞对照。图2为本发明的westernblot验证，用ha标鉴的vp2表达蛋白，经westernblot技术验证了bachbovcap表达蛋白的特异性；m：蛋白marker；1和2：ha标签vp2融合蛋白；3和4：表达vp2蛋白；5：昆虫细胞对照。图3为本发明的博卡病毒间接elisa检测临床样本所采用浓度与吸光度线性关系；log(abs)＝-2.096+0.7521log(cone)，线性系数＝0.998。具体实施方式为了进一步说明检测人呼吸道博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附测定法的实施方式和用途，参照以下实施例进行说明。实施例是为了解释而不是以任何方式限制本发明的范围，本领域技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。本发明的一种用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒，包括包被抗体、抗原、校准品、质控品、样品稀释液，所述包被抗体为单克隆抗体；所述抗原为人下呼吸道博卡病毒vp2融合蛋白；所述校准品为以prospec公司procalcitoninhumanrecombinant(hor-304，纯度≥97.0％)为参考物质制备50、100、200、400、800、3200pg/ml浓度的hbov阳性血清；所述质控品为由hbov临床检测高值人源样本配制而成，且经灭活处理，经检测其抗-tp、hbsag、抗-hcv和抗-hiv均为阴性；所述样品稀释液为检测样本的稀释液。本发明所述的用于检测人下呼吸道博卡病毒的间接酶联免疫吸附测定法试剂盒在利用重组蛋白vp2可对下呼吸道样品中的博卡病毒抗体相应抗原进行检测中的应用。所述的重组融合vp2在间接elisa技术的检测中的应用。所述的重组融合vp2在临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查药物中的应用。实施例1vp2重组蛋白的制备从ncbi数据库中获得人博卡病毒编码序列(ncbi登录号nc007455)，构建原核表达载体pcmvhbovi，诱导表达重组bachbovcap和带ha标签bachbovcapha重组抗原，经westernblot分析蛋白有免疫反应，chelatingsepharosefastflow金属和层析柱纯化大量制备bachbovcap重组蛋白。1杆状病毒表达载体构建：nedⅰ和hindⅲ双酶切从质粒pcmvhbovi上切下含有ha标记的vp2基因片段，klenow酶补平后，采用glassmilk回收；bamhⅰ酶切载体pacuw51补平后回收，t4连接酶将回收vp2片段连接到载体bamhⅰ下游，转化大肠杆菌dh5α。bamhⅰ和hindⅲ进行双酶切鉴定重组正向克隆，dna纯化试剂盒提取重组载体dna用于转染。构建pacuw51-hbov-vp2重组杆状病毒表达载体。2bachbovcap蛋白表达：纯化重组载体dna和线形杆状病毒dna共转染对数期昆虫细胞sf9。重组bachbovcap和带ha标签bachbovcapha经制备并纯化后取2μg分别与10μl脂质体混合，27℃培养6天，取0.1ml上清再次感染昆虫细胞，收集上清和细胞，用裂解液(50mmol/ltris-hclph8.5，1％np-40，10％蛋白酶抑制剂，10mmol/lβ-巯基乙醇，1mmol/lpmsf)裂解细胞，12000g离心10min后，取裂解上清进行sds-page电泳鉴定，转膜后用ha抗体进行westernblot鉴定重组融合vp2蛋白表达。结果在感染昆虫细胞内高效表达了重组融合vp2蛋白，分子量60kda，目的蛋白表达量占昆虫可溶性蛋白80％以上。用ha标鉴vp2表达蛋白，经westernblot技术验证了bachbovcap表达蛋白特异性。3重组vp2蛋白纯化：重组病毒按最佳moi感染大量细胞(2x107细胞/瓶)，72h后收集细胞，洗涤、裂解细胞，12000g离心30min，收集上清并过滤，测定蛋白浓度。制备chelatingsepharosefastflow金属亲和层析柱。用上样缓冲液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl，10％甘油，ph8.6)平衡层析柱，用洗涤缓冲液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl，10％甘油，ph7.6)洗柱直到蛋白峰值降到基线，加洗脱缓冲液(50mmol/lnah2po4，300mmol/lnacl，10％甘油，ph4.5)洗脱，收集洗脱液，分光光度计确定蛋白含量，sds-page电泳确定蛋白纯度，冷冻干燥后储于-20℃保存备用。结果表明vp2蛋白纯度达到95％以上。4.western印迹法鉴定纯化后的人博卡病毒抗原，经sds-page电泳，取出胶板，将胶浸于转移缓冲液中平衡10min；将pvdf膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。装配转移三明治：2层滤纸-膜-胶-2层滤纸。转移，电压设置24v，转移时间30min。置膜15ml封闭缓冲液(1g/100mlbsa)中4℃，过夜。tbs/t洗3次(5min/t)。加入bachbovcap单克隆抗体，室温孵育2h。tbs/t洗3次(5min/t)。加入1ml辣根过氧化酶(hrp)标记的羊抗鼠的二抗，室温孵育2h。tbs/t洗3次(5min/t)。15mltbs洗2次。加入0.5ml化学发光法液，置于凝胶成像系统中显色。结果显示：抗人博卡病毒单克隆抗体可以和人博卡病毒抗原结合反应。5.pcr检测下呼吸道博卡病毒引物的特异性引物特异性是本实验建立的检测方法中最重要因素。根据genbank中人博卡病毒序列，选取ns1特异性基因设计引物，pct-f:agcttttgttgattcaaggctataatc(seqidno.1)；pct-r:tgtttcccgaattgtttgttca(seqidno.2)。pcr扩增人博卡病毒基因，pcr体系：2xbuffer20ulpct-f2ulpct-r2ul模板1ulh2o15ulpcr程序：94℃10min1个循环，94℃30s，55℃30s，72℃30s30个循环72℃10min1个循环。pcr产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后与t载体连接，16℃连接1h获得pcmvhbovi，转化大肠杆菌dh5α。pcmvhbovi载体经酶切鉴定后，送公司测序。测序正确pcmvhbovi载体与bachbovcapha表达载体经banmhi和xhoi酶切3h后，将连接产物加到100μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰浴20min，在42℃水浴中热击90s，然后迅速置于冰上2～3min，加入900ul新鲜的lb培养基混匀后，37℃摇床培养1h，使dh5α恢复正常生长状态。将转化细胞溶液涂布含有卡那霉素lb培养基；37℃恒温培养过夜。经酶切鉴定。通过blast比对，结果显示设计引物序列均具有很高的特异性，完全达到检测人博卡病毒的要求。实施例2单克隆抗体的大量生产取1x107细胞浓度注射于balb/c小鼠腹腔，10天后收集腹水。按下列步骤进行：1.收集所得腹水以2500rpm离心，取上清。加等体积pbs(ph7.4)与1/2体积饱和硫酸铵，4℃、静置30min；2.以3000rpm，4℃，离心20min；3.去沉淀，上清加等体积饱和硫酸铵，静置30min；4.以3000rpm，4℃，离心20min；5.取沉淀，加5ml生理盐水与5ml饱和硫酸铵静置30min；6.以3000rpm，4℃，离心20min；7.沉淀加5ml生理盐水与5ml0.02m的pb缓冲液(ph7.4)；8.加8倍柱体积pb缓冲液平衡proteing凝胶柱(购自ge公司)；9.将第7步中的混合液加到凝胶柱中；10.使用10倍柱体积的pb缓冲液洗脱杂蛋白；11.用0.2mph2.8甘氨酸缓冲液洗脱抗体并收集；12.加平衡液平衡柱子。实施例3人博卡病毒的elisa检测试剂盒的制备1.制备包被有hbov单克隆抗体的多孔板：a)包被：采用0.05m、ph9.6碳酸盐缓冲液与适当浓度实施例2制备人博卡病毒单克隆抗体混合制成包被混合液，并将其加载于微孔板上，4℃包被12h；碳酸盐缓冲液标准配方：b)洗板：稀释20倍浓缩洗液至1倍浓度，使用1倍浓度洗液洗板2次。20倍浓缩洗液标准配方：c)封闭：将封闭液(磷酸氢二钠5.8g，磷酸二氢钠0.593g，氯化钠8.0g，山羊血清100ml，proclin-3000.5ml，纯化水定容至1000ml)加载于微孔板上，室温2h，甩干，干燥过夜。2.样本稀释液制备(10x)：1000ml样本稀释液包括22.4gtris碱、2.9g无水氯化钙、81.8g氯化钠、5mlproclin-300。使用时，用去离子水稀释10倍。3.底物液制备：辣根过氧化物酶底物：底物液a为含有0.6‰过氧化脲10mmol/l柠檬酸缓冲液，避光储存；底物液b为含有0.4‰tmb的5mmol/l柠檬酸缓冲液，避光储存。4.hbov校准品配制：收集hbov检测值很高阳性血清，用1x样品稀释液将阳性血清稀释，使得校准品hbov浓度梯度为50、100、200、400、800、3200pg/ml。校准品可溯源至prospec公司参考物质procalcitoninhumanrecombinant(hor-304，纯度≥97.0％)。5.hbov质控品配制：质控品收集自hbov临床检测高值人源样本，经灭活处理，经检测其抗-tp、hbsag、抗-hcv和抗-hiv均为阴性。用样本稀释液稀释至规定浓度范围内。高值质控：800pg/ml-1200pg/ml；低值质控：40pg/ml-60pg/ml。2-8℃保存备用。6.20倍浓缩洗涤液的配制：1000ml的20倍浓缩洗涤液包括：90g氯化钠、29g十二水合磷酸氢二钠、2.97g二水合磷酸二氢钠、10ml吐温20，ph值6.20-6.60。使用时，用去离子水稀释20倍。测试例测试例1.人博卡病毒elisa试剂盒使用方法1.实验前准备1.自4℃冰箱中取出试剂盒，应平衡到室温(18-25℃)，建议不少于30min。2.20倍浓缩洗涤液用纯化水或蒸馏水稀释20倍后使用。3.10倍样本稀释液用纯化水或蒸馏水稀释10倍后使用。2.试验方法1.加校准品和待测样本：取足够数量多孔板，固定于框架上。分别设置校准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置。除空白对照孔外，在校准品孔中加入稀释后校准品100ul，校准品零点孔(0pg/ml校准品)加入hbov样本稀释液100ul；待测样本孔中加入待测样本100ul，室温放置120min。2.加辣根酶标记：每孔加入稀释后的辣根酶标记100ul，(空白对照孔不加)室温放置30min。3.洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，静置5-10s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，洗5次。4.显色：每孔加入50ul底物液a和50ul底物液b，充分混匀，37℃温育15min。5.终止：显色完毕后，每孔加入50ul终止液，充分混匀。6.测定：终止反应后，应置酶标仪450nm波长(以空白孔调零)或双波长450nm/630nm下测定od值。7.计算：根据校准品浓度及对应od值，使用双对数线性拟合方式(log(x)-log(y))计算结果，结果乘以稀释倍数，即为样本最终浓度。测试例2hbov的elisa试剂盒的方法学指标1.准确度：回收率应在95％～105％之间；2.空白检出限：应不高于50pg/ml；3.测量系统的线性：在50pg/ml～3200pg/ml范围内线性相关系数r≥0.9900。准确性、最低检出限、系统线性检测结果如表1所示：表14批内稳定性试验：取4份阳性血清标本，在同块酶标板进行重复9次elisa测定，计算出批内稳定实验变异系数在5.6％-8.1％之间，平均6.87％，具有良好的稳定性和重复性。批内稳定试验变异系数计算结果如表2所示：表25批间重复性试验：取5份阳性血清标本，进行同等质量不同酶标板重复3次elisa实验测定，计算出批间重复实验变异系数在0.74％-8.12％之间，平均4.67％，具有良好的稳定性和重复性。批间重复试验变异系数计算结果如表3所示：表36特异吸收抑制试验：用特异vp2抗原与血清作用后，其od显著降低，阴性血清抑制率6.67趋近于0，8份阳性血清抑制率介于50.44-56.94之间，特异吸收抑制试验均为阳性，说明该方法具有较好的特异性。特异吸收抑制试验结果如表4所示：表47抗体的敏感度试验：6份抗hbov抗体阳性血清用所建立间接elisa法测出抗体效价均＞1:800，试管凝集试验测出抗hbov抗体效价为1:160-1:640，显示出间接elisa方法具有良好的敏感度。elisa测定hbov抗体敏感比较结果如表5所示：表58不同方法检测临床标本比较：在40例标本中，间接elisa法检测出hbov抗体阳性2例，阳性率5.0％；荧光定量pcr检测出hbov阳性2例，阳性率5.0％，并且两种方法检测出同一份标本；经westernblot技术验证2例标本均在60kd处出现条带；两种方法检测出hbov阳性符合率100％。elisa检测与荧光定量pcr检测临床标本结果如表6所示：表69标本筛选：采集浙江省温岭市第一人民医院急性呼吸道感染患者鼻咽部抽取物、咽拭子和血清各520例标本，患者年龄2m-6y，临床均出现不明原因发热，咳嗽等症状。以人博卡病毒vp2重组蛋白作为特异性抗原，对血清标本中的抗体进行蛋白免疫印迹检测，两种方法共确认出13例人博卡病毒感染阳性患者。13例感染人博卡病毒阳性患者详细资料如表7所示：表7以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。当前第1页12