本发明属于植物生理技术领域，涉及一种高效快速测定植物成熟叶片色素的方法，特别涉及使用紫外分光光度计测定植物叶片色素的方法，适合于测定植物成熟叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。
背景技术
高等植物叶片色素的构成主要包含叶绿素和类胡萝卜素，叶绿素主要包含叶绿素a和叶绿素b，类胡萝卜素主要分为胡萝卜素和叶黄素两大类。叶绿素是植物进行光合作用的重要成分，也是反映植物生理状况的重要指标。类胡萝卜素不仅作为光合作用中的辅助色素参与光能的吸收和传递，还具有抗氧化、抗癌以及抗辐射的作用。因此，叶绿素和类胡萝卜素的提取和测定在生产和科研工作中非常重要。
提取植物组织中色素的主要有机溶剂包括氯仿、石油醚、丙酮、乙醇和二甲基亚砜等，通常使用丙酮和乙醇按一定比例进行混合或其水溶液提取植物色素。目前，以丙酮提取法使用最为广泛，最早于1941年由mackinney提出(mackinneyg.absorptionoflightbychlorophyllsolutions[j].journalofbiologicalchemistry,1941,140(2):315-322.)，1949年经arnon解释和推导(arnondi.copperenzymesinisolatedchloroplasts.polyphenoloxidaseinbetavulgaris[j].plantphysiology,1949,24(1):1-15.)，该法的产生革新了最早的叶绿素皂化测定法，操作相对简单，耗时大幅缩短。
丙酮提取法主要是使用80％丙酮进行研磨提取，然后经过洗转、过滤和定容等步骤，过程较为复杂，且色素测定值偏低。苏展等人将此法进行改进并提出了叶绿素简化提取法，即将植物绿色组织剪碎后直接使用80％丙酮浸提(苏展,张晓素,陈娟,等.叶绿素含量测定的简化[j].植物生理学通讯,2010,46(4):399-402.)。这一方法大大简化了操作过程，节省了植物材料和试剂的用量，但提取时间过长，一般需要24-72小时才能提取完全。邱念伟等人发明了dmso-80％丙酮两步快速提取法，先用dmso高温提取叶绿素，再用80％丙酮稀释浸提，可以有效减小测定误差，加快测定速度，将提取时间缩短到3个小时(邱念伟,王修顺,杨发斌,等.叶绿素的快速提取与精密测定[j].植物学报,2016,51(5):667-678.)。吴志旭等人改用热丙酮浸提叶绿素，使浸提时间缩短为1.5-2.5小时(吴志旭,张雅燕.浮游植物体内叶绿素a测定方法的改进[j].化学分析计量,2002,11(6):37-38.)。即便如此，以上方法仍较为繁琐，提取时间较长或存在安全隐患，客观上难以做到避光操作，因而色素提取效率不高。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题：现有叶绿素和类胡萝卜素提取过程复杂、耗时长以及效率低等问题。为解决上述技术问题，本专利申请发明人根据文献调研结果获知，国内外尚无利用液氮辅助测定植物叶片色素的报道。
为了简化色素的提取步骤，缩短色素的提取时间以及提高色素的提取效率等问题，本发明提供一种植物成熟叶片色素测定方法。本发明通过探索最佳的色素提取方式，筛选最佳提取时间、温度以及质量体积比，以实现植物成熟叶片色素的快速提取和精确测定。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
植物成熟叶片色素测定方法，包括供试样品制备步骤和比色法检测步骤，其所述供试样品制备步骤包括：使用液氮冷却植物叶片，粉碎后用溶剂提取叶片中的色素，提取液离心，取上清液，制得供试样品。
作为本发明所述技术方案的优选实施方式之一，其所述供试样品制备步骤具体包括：将植物叶片置入事先预冷的研钵中，倒入少许液氮进行充分研磨，加入溶剂将叶片粉碎物洗转至离心管中，在一定温度和光照条件下浸提一定时间后离心，上清液即为供试样品。
作为本发明所述技术方案的优选实施方式之一，所述溶剂选用丙酮，或乙醇，或丙酮和乙醇的混合溶液，或丙酮、乙醇和水的混合溶液。
进一步优选地，所述溶剂选用丙酮和乙醇的混合溶液，以体积比计，丙酮:乙醇＝1:1，或丙酮:乙醇＝2:1，或丙酮:乙醇＝1:2；所述溶剂选用丙酮、乙醇和水的混合溶液，以体积比计，丙酮:乙醇:水＝6:3:1，或丙酮:乙醇:水＝3:6:1，或丙酮:乙醇:水＝4.5:4.5:1。经本发明实施例的结果验证，植物叶片色素的最佳提取溶剂为丙酮:乙醇:水＝4.5:4.5:1的混合溶液(体积比)。
作为本发明所述技术方案的优选实施方式之一，所述浸提温度为-20～37℃。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取温度为4℃。
作为本发明所述技术方案的优选实施方式之一，所述浸提光照强度为0～1000lux。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取光照条件为0lux(黑暗条件)。
作为本发明所述技术方案的优选实施方式之一，所述浸提时间为1～60min。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取时间为10min。
作为本发明所述技术方案的优选实施方式之一，以g/ml计，待测植物叶片与提取溶剂的质量体积比范围为1/400～1/25。进一步优选地，植物叶片色素的最佳提取质量体积比为1/100(叶片与溶剂，g/ml)。
对于本发明所述的植物成熟叶片色素测定方法，其所述比色法检测步骤包括：测定供试样品在663nm、646nm和470nm处的吸光度值，利用wellburn改良法计算叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的含量。
本发明所述的植物成熟叶片色素测定方法，尤其适用于植物成熟叶片色素的高效快速测定。
基于上述参数的优化，本发明给出一种优化的植物成熟叶片色素测定方法，其包括供试样品制备步骤和比色法检测步骤：
(1)供试样品制备
称取适量植物叶片加入事先预冷的研钵中，倒入少许液氮进行充分研磨，按一定质量体积比分三次加入提取溶剂，将研磨液洗转到离心管中，再用锡箔纸裹住离心管，在一定温度和光照条件下浸提一定时间后离心，上清液即为供试样品。
(2)比色法检测
将步骤(1)制得的供试样品使用比色法进行检测，测定其在663nm、646nm和470nm处的吸光度值，使用wellburn改良法(wellburnar,lichtenthalerhk.formulaeandprogramtodeterminetotalcarotenoidsandchlorophyllsaandbofleafextractsindifferentsolvents[m].1984:springernetherlands.9-12.)计算色素含量。
wellburn改良法计算色素含量的公式如下：
ca(mg/gfw)＝(12.21a663–2.81a646)×v/(1000×w)；
cb(mg/gfw)＝(20.13a646–5.03a663)×v/(1000×w)；
c总(mg/gfw)＝(17.32a646+7.18a663)×v/(1000×w)；
cx·c(mg/gfw)＝[(1000a470–3.27ca–104cb)/229]×v/(1000×w)。
式中：
ca——叶绿素a含量；
cb——叶绿素b含量；
c总——叶绿素总含量；
cx·c——类胡萝卜素含量；
a663——样品在663nm处的吸光度值；
a646——样品在646nm处的吸光度值；
a470——样品在470nm处的吸光度值；
v——样品体积，单位为毫升(ml)；
w——叶片鲜重，单位为克(g)；
mg/gfw——叶片色素的含量单位，mg/g鲜重。
本发明综合了上述现有技术的优缺点，提供了一种高效快速测定植物成熟叶片色素的方法，简称液氮法，即使用液氮对植物叶片进行迅速冷却，于事先预冷的研钵中快速粉碎，再使用溶剂进行洗转、避光提取。该法针对成熟叶片色素的提取，可以缩短研磨时间且使叶片研磨更加充分，色素提取效率更高，整个提取过程不超过10min。相比于以往的色素提取研究，该法提取过程简单，时间短，效率高，测定结果稳定，可用于科研工作和工业生产中对植物成熟叶片材料中色素的快速提取和精确测定。
具体地，本发明所述利用液氮法测定植物成熟叶片中的色素，至少具有下述的有益效果或优点。
1)本发明采用液氮对植物叶片进行快速凝结，降低叶片温度，可有效降低色素在粉碎过程中的降解速度，使测定结果更加准确。
2)本发明使用液氮可使叶片粉碎的更加充分，并且大幅缩短叶片粉碎的时间，提高色素的溶出效率。
3)本发明通过筛选最佳的提取溶剂、温度、光照条件、时间以及叶片和溶剂的质量体积比，优化测定色素过程中的各个环节，有效缩短色素的提取时间，增加了色素的溶出效率。
4)本发明利用wellburn改良arnon的公式(1984)计算叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素的含量，提高了色素测定的精确度。
附图说明
图1是不同溶剂对中华蚊母树成熟叶片色素提取效率的影响。
图2是不同溶剂对栀子树成熟叶片色素提取效率的影响。
图3是不同溶剂对银杏成熟叶片色素提取效率的影响。
图4是不同浸提时间对中华蚊母树成熟叶片色素提取效率的影响。
图5是不同浸提时间对栀子树成熟叶片色素提取效率的影响。
图6是不同浸提时间对银杏成熟叶片色素提取效率的影响。
图7是中华蚊母树成熟叶片与溶剂的质量体积比对色素提取效率的影响。
图8是栀子树成熟叶片与溶剂的质量体积比对色素提取效率的影响。
图9是银杏成熟叶片与溶剂的质量体积比对色素提取效率的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述各实施例仅用于说明本发明，对本发明并没有限制。本研究领域的普通技术人员可以参考本实施例的描述，或以本实施例所述方法为依据进行技术手段的替换或适当变更与组合，以更优选的方式实现本发明。
实施例1
本实施例一种植物成熟叶片色素测定方法，在本发明中，这种测定方法也称为液氮法。本实施例利用液氮法测定植物成熟叶片中的色素，包括不同色素提取方式的比较以及筛选最佳的提取溶剂、温度、光照条件、浸提时间以及叶片与溶剂的最佳质量体积比。
一、材料与方法
(1)不同提取方式比较
分别采用液氮法、研磨法以及浸提法3种不同方式对叶片中的色素进行提取，对不同色素提取方式进行比较。
液氮法：称取一定质量的叶片到事先预冷的研钵中，快速粉碎，加入溶剂进行洗转、避光提取。
研磨法：称取一定质量的叶片到研钵中，加入少许石英砂于冰浴条件下充分研磨，加入溶剂进行洗转、避光提取。
浸提法：将叶片充分剪碎，称取一定质量的叶片到离心管中，加入一定体积的溶剂浸提24h。
(2)不同提取溶剂
使用8种不同的有机提取溶剂对植物叶片的色素进行提取。这8种溶剂分别为：
(1)80％丙酮；
(2)95％乙醇；
(3)丙酮：乙醇＝1:1；
(4)丙酮：乙醇＝2:1；
(5)丙酮：乙醇＝1:2；
(6)丙酮：乙醇：水＝6:3:1；
(7)丙酮：乙醇：水＝3:6:1；
(8)丙酮：乙醇：水＝4.5:4.5:1。
采用液氮法将叶片粉碎，分别加入以上8种溶剂进行洗转、提取，1d后测定色素含量。
(3)不同环境因素
研究不同的温度、光照条件以及提取时间对不同类型植物叶片色素提取的影响。温度分别设置-20℃、4℃、25℃以及37℃四个梯度，光照条件设置0lux、100lux、1000lux三个梯度，提取时间设置1min、3min、5min、10min、20min、30min、60min七个梯度。以三种植物叶片(中华蚊母树成熟叶片、栀子树成熟叶片、银杏成熟叶片)为材料，采用最佳的提取溶剂和液氮法进行色素的提取。
(4)不同质量体积比
为确定植物叶片色素提取过程中叶片质量与提取溶剂的最佳比例，按叶片质量(g)与提取溶剂的体积(ml)的比例分别为1/25、1/50、1/100、1/200、1/400进行设置，使用液氮法在最佳提取温度、最优光照条件以及最适提取时间下探索色素提取的最佳质量体积比。
(5)叶绿素和类胡萝卜素的测定
赵先明等人(赵先明,汪艳霞,杜晓,等.茶叶叶绿素混合液浸提法提取条件优化[j].西南农业学报,201124(4):001303-1308.)和杨敏文(杨敏文.快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨[j].光谱实验室,2002,19(4):478-481.)的研究结果表明，叶绿素在80％丙酮等8种不同溶剂中的光吸收特性类似，因此可使用arnon公式计算叶绿素和类胡萝卜素的含量。但有研究表明，arnon法在吸收波长和计算公式方面均有较大误差，为了提高效率和研究方便，本研究采用wellburn等人于1984年修正的叶绿素和类胡萝卜素的计算公式：
ca(mg/gfw)＝(12.21a663–2.81a646)×v/(1000×w)；
cb(mg/gfw)＝(20.13a646–5.03a663)×v/(1000×w)；
c总(mg/gfw)＝(17.32a646+7.18a663)×v/(1000×w)；
cx·c(mg/gfw)＝[(1000a470–3.27ca–104cb)/229]×v/(1000×w)。
式中：
ca——叶绿素a含量；
cb——叶绿素b含量；
c总——叶绿素总含量；
cx·c——类胡萝卜素含量；
a663——样品在663nm处的吸光度值；
a646——样品在646nm处的吸光度值；
a470——样品在470nm处的吸光度值；
v——样品体积，单位为毫升(ml)；
w——叶片鲜重，单位为克(g)；
mg/gfw——叶片色素的含量单位，mg/g鲜重。
二、结果与讨论
(1)最佳提取方式
不同提取方式对叶片色素提取效率的影响见表1。表1显示，三种叶片色素的提取效率以液氮法最高，测定的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素均显著高于传统的研磨法和浸提法。
表1不同提取方式对色素提取效率的影响
(2)最佳提取溶剂
图1是不同溶剂对中华蚊母树成熟叶片色素提取效率的影响。图2是不同溶剂对栀子树成熟叶片色素提取效率的影响。图3是不同溶剂对银杏成熟叶片色素提取效率的影响。综合图1至图3可得，提取溶剂(1)80％丙酮；(2)95％乙醇；(3)丙酮：乙醇＝1:1；(4)丙酮：乙醇＝2:1；(5)丙酮：乙醇＝1:2；(6)丙酮：乙醇：水＝6:3:1；(7)丙酮：乙醇：水＝3:6:1；(8)丙酮：乙醇：水＝4.5:4.5:1均能实现本实施例的植物成熟叶片中的色素的有效提取。就本实施例而言，这三种叶片的最佳提取溶剂为丙酮：乙醇：水＝4.5:4.5:1的混合溶液。
(3)最佳提取温度
不同提取温度对叶片色素提取效率的影响见表2。表2显示，浸提温度为-20～37℃均能实现本实施例的植物成熟叶片中的色素的有效提取。就本实施例而言，这三种叶片的最佳提取温度均为4℃。
表2不同温度对色素提取效率的影响
(4)最佳光照条件
不同光照条件对叶片色素提取效率的影响见表3。从表3可以看出，浸提光照强度为0～1000lux均能实现本实施例的植物成熟叶片中的色素的有效提取。就本实施例而言，这三种叶片色素提取的光照条件以黑暗(0lux)中进行最佳。
表3光照强度对色素提取效率的影响
(5)最佳浸提时间
图4是不同浸提时间对中华蚊母树成熟叶片色素提取效率的影响。图5是不同浸提时间对栀子树成熟叶片色素提取效率的影响。图6是不同浸提时间对银杏成熟叶片色素提取效率的影响。综合图4至图6可得，浸提时间为1～60min均能实现本实施例的植物成熟叶片中的色素的有效提取。就本实施例而言，这三种叶片色素提取的最佳浸提时间为10min。
(6)最佳质量体积比
图7是中华蚊母树成熟叶片与溶剂的质量体积比对色素提取效率的影响。图8是栀子树成熟叶片与溶剂的质量体积比对色素提取效率的影响。图9是银杏成熟叶片与溶剂的质量体积比对色素提取效率的影响。综合图7至图9可得，以g/ml计，待测植物叶片与提取溶剂的质量体积比范围为1/400～1/25均能实现本实施例的植物成熟叶片中的色素的有效提取。就本实施例而言，这三种叶片色素提取的最佳质量体积比为1/100。
三、结论
三种植物成熟叶片色素的最佳提取条件见表4。如表4所示，三种成熟叶片以液氮法色素提取效率最高，色素的最佳提取溶剂为丙酮：乙醇：水＝4.5:4.5:1的混合溶液，最佳提取温度为4℃，色素提取光照条件为在黑暗中进行最佳，叶片色素的最适提取时间为5min，叶片与溶剂的质量体积比为1/100时色素溶出率最高。
表4三种植物成熟叶片色素的最佳提取条件
实施例2
本实施例将实施例1中的液氮法与传统的研磨法和浸提法进行比较，取成熟的紫薇叶片，作为本实施例的实验材料。分别按照液氮法、研磨法以及浸提法三种方式对紫薇叶片中的色素进行提取和测定，比较不同方法测定植物成熟叶片色素含量间的差异。
三种不同测定方法对紫薇成熟叶片色素的提取效率见表5。从表5可以看出，三种测定方法中以液氮法提取色素的效率最高，测定的叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素均显著高于传统的研磨法和浸提法，且时间最短，因此可作为植物成熟叶片色素测定的最佳方法。
表5三种不同测定方法对紫薇成熟叶片色素的提取效率比较
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。