一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法与流程

本发明涉及血清检测技术领域，尤其涉及一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法。

背景技术：

近年发展起来的在线固相萃取液相色谱技术能够实现样品的在线富集，最大程度减少人工操作和人为误差，以其自动高效的特点正逐渐应用于环境、生物等样品中痕量目标物的分析。在线湍流固相萃取柱(turboflow-spe)的填料特点是结合了体积排阻和反相色谱的保留特性，由于填料颗粒物尺寸较大(60μm)，样品在高流速状态下呈湍流状态，可去除大分子，保留小分子；turboflow-spe技术已被用于水样、尿样及血液样品中痕量污染物的检测，但目前尚没有血清中针对自由态小分子化合物的全自动在线湍流固相萃取检测技术的相关报道。

现有技术方案中，针对血清中自由态小分子化合物的常用检测方法是：通过半透膜或者超滤的方法将样品中自由态小分子的分离与提取，然后再经过一系列前处理进行浓度检测，但通常提取过程步骤复杂，在提取完成后至进入分析仪器前还需进行一系列前处理。并且这些传统方法需要消耗大量的时间和人力，需要的样品量较大，基质去除效果不理想，同时前处理过程也因提取小分子方法不同而不同，并且实验结果受到实验人员操作的影响。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法，该系统无需再经过复杂的人工前处理过程，直接将血清引入分析检测系统，解决了传统血清中自由态检测分析方法前处理过程耗时耗力的问题。该方法无需人工处理，避免了人工操作带来的实验误差，因此重现性良好，提高了检测效率以及检测结果的准确性。

一种全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的方法，包括：

(1)利用双三元液相色谱仪的自动进样器直接吸取血清样品，向净化柱正向加载，并对分析柱进行冲洗；

(2)在血清样品加载完成后，对所述净化柱反冲洗脱目标化合物，并对所述分析柱进样；

(3)在反冲洗脱阶段结束后，进行自由态小分子化合物质谱检测；

其中，所述双三元液相色谱仪的左泵和右泵所使用的流动相溶剂按如下方式配制：

左泵流动相：a：超纯水；b：乙腈；c：甲醇∶乙腈∶水∶异丙醇＝1∶1∶1∶1；右泵流动相：a：10mmol/l醋酸铵，ph＝5；b：乙腈；c：甲醇∶乙腈∶水∶异丙醇＝1∶1∶1∶1。

优选地，所述方法的在线固相萃取以及液相色谱加载和洗脱条件为：

其中，a.表示样品负载和样品分析过程六通阀位置；b.表示样品洗脱过程六通阀位置。

优选地，10mmol/l醋酸铵溶液的配制方法为：取0.77g醋酸铵，与990ml超纯水混合，用冰醋酸调节ph至5后，再加水稀释至1000ml后混匀。

优选地，所述净化柱采用湍流固相萃取柱turboflowcyclone-p、turboflowcyclone、c18色谱柱或者c18-pxl色谱柱。

优选地，所述分析柱采用硅胶基质碳18反相色谱柱acclaim120c18、zorbaxextendc18色谱柱或者waterssunfirec18色谱柱。

优选地，步骤(1)中，所述左泵依次通过第二管路接口、第一管路接口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，用于在所述净化柱上正向加载血清样品；所述右泵依次通过第五管路接口、第六管路接口与所述分析柱连接，用于对所述分析柱进行净化冲洗。

优选地，步骤(2)中，所述左泵依次通过第二管路接口、第三管路接口与废液池连接；所述右泵依次通过第五管路接口、第四管路接口、净化柱、第一管路接口、第六管路接口与分析柱连接，用于对所述净化柱反冲洗脱目标化合物，实现对样品在分析柱上的富集。

优选地，步骤(3)中，所述左泵依次通过第二管路接口、第一管路接口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，用于正向冲洗净化柱；所述右泵依次通过第五管路接口、第六管路接口与所述分析柱连接，样品流出所述分析柱接入三重四级杆质谱检测仪，由所述三重四级杆质谱检测仪对血清样品中的自由态小分子化合物进行质谱检测。

优选地，所述血清样品处理的方式为：血清样品离心匀质后，不经过任何处理，直接进行检测。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，该系统无需再经过复杂的人工前处理过程，解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题，同时该方法无需人工处理，因此重现性良好，避免了人工操作带来的实验误差。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为本发明实施例所提供全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的系统样品负载和样品分析管路连接示意图；

图2为本发明实施例所提供全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的系统样品分析管路连接示意图。

图3是本发明实施例中各个化合物在不同ph值下的峰面积。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

下面将结合附图对本发明实施例作进一步地详细描述，如图1所示为本发明实施例所提供全自动在线检测血清中自由态小分子化合物的系统结构示意图样品负载和样品分析过程管路连接，所述系统包括净化柱、分析柱、双三元液相色谱仪、三重四级杆质谱检测仪，其中：

所述双三元液相色谱仪具体包含：左泵、右泵、第一管路接口、第二管路接口、第三管路接口、第四管路接口、第五管路接口和第六管路接口，且相邻的管路接口之间设有切换阀门；

利用双三元液相色谱仪的自动进样器直接吸取血清样品，向所述净化柱正向加载，并对所述分析柱进行冲洗；在该过程中，参考图1(实线为左泵流通线路，虚线为右泵流通线路)：所述左泵依次通过第二管路接口、第一管路接口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，用于在所述净化柱上正向加载血清样品；所述右泵依次通过第五管路接口、第六管路接口与所述分析柱连接，用于对所述分析柱进行净化冲洗；

在血清样品加载完成后，对所述净化柱反冲洗脱目标化合物，实现对所述分析柱进样；在该过程中，如图2所示为该系统的样品洗脱过程管路连接示意图，参考图2(实线为左泵流通线路，虚线为右泵流通线路)：所述左泵依次通过第二管路接口、第三管路接口与废液池连接，用于冲洗管路；所述右泵依次通过第五管路接口、第四管路接口、净化柱、第一管路接口、第六管路接口与分析柱连接，用于对所述净化柱反冲洗脱目标化合物，实现对样品在分析柱上的富集。

在反冲洗脱阶段结束后，进入自由态小分子化合物质谱检测阶段，在该过程中，管路连接由六通阀切换到参考图1所示的管路连接阶段，所述左泵依次通过第二管路接口、第一管路接口、净化柱、第四管路接口、第三管路接口与废液池连接，左泵用于正向冲洗净化柱，实现净化柱再生目的；所述右泵依次通过第五管路接口、第六管路接口与所述分析柱连接，样品流出分析柱接入所述三重四级杆质谱检测仪，由所述三重四级杆质谱检测仪对血清样品中的自由态小分子化合物进行质谱检测。

上述血清样品的前处理方式为：首先采集人体血液样品，取血清部分25ul，添加转移至进样小瓶中待测。

对于质谱检测后的数据分析，外标法进行定量，进样前需配制标准曲线，标准曲线配制方法为：将混合标准溶液用乙腈配制成0.05-100ng/ml，包括0.05、0.2、0.5、2、5、10、20、50、100ng/ml的9点标准系列，对标准曲线每日进行分析，在测定实际血清样品时，每隔10次进样，重复测定5ng/ml标准溶液。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的基于在线spe的快速测定血清中自由态小分子化合物的方法，可实现样品的在线净化富集-样品洗脱-质谱检测，无需再经过复杂的人工前处理过程；解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题，将原来需要1天左右的分析时间减少到在18分钟内即可获得分析结果；解决了因前处理过程中样品量流失而造成的回收率过低问题，该方法得到的结果可以作为确证方法使用；同时无需人工处理，因此重现性良好，避免了人工操作带来的实验误差，提高样品检测效率及准确性。

在具体实现中，所述净化柱可以采用turboflowcyclone-p柱(湍流固相萃取柱)或根据检测化合物的不同而调整使用其他性能的色谱柱，如turboflowcyclone，c18以及c18-pxl等；所述分析柱可以采用acclaim120c18柱(硅胶基质碳18反相色谱柱)或根据检测化合物的不同而调整使用其他性能的色谱柱，如碳18反相色谱柱：zorbaxextendc18色谱柱、waterssunfirec18色谱柱等。这里净化柱的选择方面，使用了一种新型净化柱——turboflowcyclone-p柱，其特点是可根据化合物物理性质和化学性质的差异对其进行选择性保留，在较高的流速下，大分子在柱内几乎无保留，小分子则可在湍流作用下进入柱内微小孔径，增加柱内驻留时间。因此这种净化柱可被用于对大分子和小分子的分离，从而对小分子进行检测，由于血清样品中含有的大分子蛋白、多肽等成分，会对分析造成干扰，使用该新型净化柱(turboflowcyclone-p柱)可过滤这些杂质成分，更利于之后连接的串联质谱进行检测。

值得注意的是，对于净化柱和分析柱来说，其他功能相似的色谱柱也可以达到与本发明相似的检测效果。

通过上述系统的优化，还可以节省在线净化时间，完成血清样品的在线净化、在线分离、检测工作，无需人工进行太多处理，非常适用于大规模血清中自由态小分子化合物的检测工作，即使没有太多经验的操作人员，也可完成该项工作。

另外，通过上述系统的检测，可以同时检测包括与蛋白具有高、中、低结合能力的小分性化合物，例如：雷尼替丁、西咪替丁、甲氧苄啶、普萘洛尔、地西泮、三甲基磷酸酯、6-羟基-2，2′，4，4′-四溴二苯醚、四溴双酚a等多种化合物。同时本领域技术人员还可以通过调整液相色谱加载和洗脱时间及流动相来增加或减少检测化合物种类或范围。

具体实施例中，液相色谱加载和洗脱的时间如下表1所示：

表1在线spe和液相色谱加载和洗脱条件

其中，a表示样品负载和样品分析过程六通阀位置；b表示样品洗脱过程六通阀位置。

其中，左右泵所使用的流动相溶剂按如下方式配制：

左泵流动相：a：超纯水；b：乙腈；c：甲醇∶乙腈∶水∶异丙醇＝1∶1∶1∶1；右泵流动相：a：10mm醋酸铵；b：乙腈；c：甲醇∶乙腈∶水∶异丙醇＝1∶1∶1∶1。其中，优选地，10mmol/l醋酸铵溶液(ph＝5)，其配制方法为：取0.77g醋酸铵，与990ml超纯水混合，用冰醋酸调节ph至5后，再加水稀释至1000ml后混匀。

本发明使用ph＝7的超纯水作为负载流动相，在未破坏化合物和蛋白结合的情况下，将大分子蛋白连同结合态化合物一起排出体系，从而只留下自由态化合物，进入hplc-ms/ms进行检测。为了说明本研究检测自由态浓度与已有研究中检测总浓度的差异，本发明使用甲酸或氨水溶液，配成不同ph(3，5，9)的缓冲溶液，另外用超纯水(ph＝7)作为流动相，对比了不同ph的负载流动相条件下，检测两种溶液：一种是小分子(浓度为10ng/ml)的0.6μmol/l血清白蛋白(hsa)溶液(溶液a)，另一种为小分子(浓度为10ng/ml)的水溶液(溶液b)。两种溶液分别进入本研究的onlineturboflowspehplc-ms/ms系统后，对比目标小分子化合物的色谱峰峰面积。

如图3所示，ph＝3时，在溶液a和溶液b中各个化合物的峰面积的比值范围为68.9至104％，说明在ph为3时，影响了蛋白的活性，破坏了蛋白质与化合物之间的作用力，从而时结合态化合物释放出，该种条件下检测的即为化合物的总浓度，而ph＝7时，化合物与蛋白之间的作用没有被破坏，结合态化合物随蛋白一起排出体外，这时就是检测的自由态浓度。ph＝5时，蛋白活性同样受到影响，部分结合态化合物得到了释放。而在ph＝9的碱性条件下，蛋白活性同样受到影响，从而结合态的化合物被释放出来，该种情况下，检测的也不是自由态化合物。另外，碱性条件下，某些化合物发生了水解，如8∶2dipap，同时，由于本研究所使用的turboflow柱的耐受ph范围为2-9，从而造成在碱性条件下对某些化合物的保留效果不稳定。

综上所述，使用ph＝7的超纯水作为负载流动相，可以检测自由态化合物浓度，在其他ph条件下检测的都为结合态浓度。

本发明实施例所提供的系统可实现血清样品的在线净化，无需再经过复杂的人工前处理过程，解决了传统仪器分析方法前处理过程耗时耗力的问题，将原来需要1天左右的分析时间减少到18分钟内即可获得分析结果；同时该方法无需人工处理，因此重现性良好，避免了人工操作带来的实验误差。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。