一种测定电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子内能差异的方法与流程

本发明属于分析化学领域，涉及质谱分析技术领域，尤其涉及一种测定电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子内能差异的方法。

背景技术：

电喷雾电离质谱(esi-ms)技术与电喷雾萃取电离质谱(eesi-ms)技术都可用于小分子、多肽、蛋白质、核酸等大分子的检测，在化学、生物、药学、医学、环境等领域有重要用途。esi与eesi均属于软电离技术，但二者的工作原理与分析性能既有区别也有联系。在esi中，高压电场直接施加在流过窄小毛细管(内径100μm)的分析样品溶液中，待测物直接暴露在高强电场(e.g.,+3kv/m)中，经过较长时间(e.g.,10s，以流速5μl/min，毛细管长度10cm为例计算结果)作用后流出毛细管，并在电场及辅助气作用下发生电离和雾化作用，生产的带电液滴经过去溶等过程形成离子供后续质谱检测。eesi与esi显著不同，样品(一般都含有复杂基体)在电中性的条件(即无电场作用)下被气动雾化，形成微小液滴后，再与由esi产生的试剂液滴(甲醇/水)在敞开的大体积(约200cm³)空间中交叉、碰撞、融合，伴随着发生在敞开环境中的液-液微萃取过程(约50ms)在三维空间内完成能荷传递作用，形成目标分子离子。值得注意的是，eesi过程中，待测物分子或离子始终没有与强电场直接接触，而是通过沐浴在由esi产生的带电液滴组成的“电荷雨”中而获得电荷，继而经过去溶等过程形成离子供后续质谱检测。显然，在相同的实验条件下，eesi过程传递给目标离子的能量要比esi更低一些。研究证明，eesi能够保持蛋白质的构象和生物活性，而esi条件下的蛋白经过电离的影响丧失了大部分生物活性。这表明eesi是一种比esi更温和的软电离技术，也说明eesi与esi在性能方面(提供给母离子的内能等)存在显著差异。但它们具体存在多大的内能差异尚不清楚。迄今为止，也未见采用质谱仪对这两种离子源所产生的离子的内能差异进行测定的方法报道。因此，建立esi与eesi内能差异的测量方法很有必要。

离子自生成后即处于激发态，含有一定的内能，而碎片离子形成与否及母离子不同的碎裂方式是由母离子的内能大小决定的。离子最初的内能是来自离子源。不同类型的离子源所赋予同一种离子的能量是不同的，导致所形成离子的内能也有差异。比如，电子轰击电离源具有的能量高达70ev，这些能量直接作用在样品分子上产生具有高内能的自由基阳离子，剩余的能量进一步使其裂解产生碎片离子。如果采用温和的软电离源，则很少产生碎片离子，但可通过改变离子源的参数来诱导产生碎片离子。近年来，关于离子源中离子内能的测定方法已有不少文献报道，比如温度计离子法(int.j.massspectrom.ionprocesses,1987,75(2):181-208)、去卷积法(j.phys.chem.,1986,90(16):3569-3577)、离子生存率法等(rapidcommun.massspectrom.,1998,12(4):165-170，rapidcommun.massspectrom.,1998,12(22):1673-1678)。温度计离子法是用来估算储存在母离子中的内能分布，主要用于在热力学上表征离子的连续碎裂过程。去卷积法是一种确定离子内部能量的方法。离子生存率方法是将分子的碎裂程度与内能相关联，主要应用在软电离中。该方法基于两个假设，即具有相同的自由度的离子其内能分布相似，离子的内能在高于离子本身的解离阈值之前是不会发生碎裂的。然而，这些方法大多都是采用源内碰撞诱导解离(源内cid)技术，通过调节离子传输过程中加速电压(锥孔电压)来计算离子内能的分布。采用源内cid技术的不足之处在于缺少母离子的选择、富集过程，在电离过程中产生的所有离子都会被碰撞活化，而且由于源内cid的能量比cid的能量要低些，导致碎裂的时间尺度延长，直接碎裂解离速率更小，因此易发生重排反应，最终使测定的平均内能值往往比高能量cid技术测定的平均内能值更低。同时，离子生存率方法没有考虑动力学位移，通常需要获得比临界能更高的内能时才能得到碎片离子，采用该方法测定的平均内能分布值往往比实际偏小。而cid技术可以对母离子进行选择、活化等，避免了其它离子的干扰。因此，该技术适合用来分析不同离子源的内能差异。目前，并没有利用cid技术来计算不同离子源的内能差异的方法。

技术实现要素：

本发明通过碰撞诱导解离技术研究，考察不同碰撞能量对分子裂解行为的影响，建立了eesi和esi两种离子源一价正离子内能差异的测定方法，对eesi和esi的内能差异进行定量测定。该方法具有快速、简便、易操作等特点，可为理解不同离子源产生离子的质谱行为提供参考依据。

本发明提供了一种测定电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子内能差异的方法，方法如下：使用串联质谱，分别通过电喷雾电离和电喷雾萃取电离两种离子源使样品溶液中的目标分子离子化形成一价正离子母离子，在毛细管传输作用下进入离子阱，经碰撞诱导解离技术得到丰富的碎片离子；上述过程中保持电喷雾电离和电喷雾萃取电离的传输条件与碰撞条件一致，改变离子阱中的碰撞能量，使母离子碰撞诱导解离，在电喷雾电离串联质谱和电喷雾萃取电离串联质谱两种模式下，分别调控碰撞诱导解离能量使所得到同种碎片离子的强度相等时，所述碰撞诱导解离过程中的能量差异即为一价正离子所获得的内能差异。

串联质谱中，影响离子的总内能变化主要包括三部分，即离子化过程的能量，离子传输过程的能量和离子阱中的碰撞能量。要形成相同强度的同种碎片离子，母离子获得的总内能是一定的。那么保持离子化条件和离子传输条件一致，仅改变离子阱中的碰撞能量，碎片离子峰强度会有明显差异，即得到的碎片离子丰度差异非常明显，而导致产生碎片离子丰度差异的原因在于离子化过程的能量差异，即是由于eesi与esi传递给目标分子之间的内能差异，因此可以通过测定一价正离子碰撞诱导解离过程中的能量差异，来计算电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异。

进一步地，从零开始增加碰撞能量，当所述电喷雾萃取电离所获母离子碰撞诱导解离后得到的碎片离子的强度等于电喷雾电离所获母离子碰撞诱导解离后开始得到的碎片离子的强度时，两者碰撞诱导解离过程中碰撞能量的差值即为所述两种离子源提供给母离子的内能差异。

进一步地，所述碰撞能量取值为0％～100％。

进一步地，所述内能差异的计算方法如下：

定义eion为母离子获得的总内能，esou为离子源给母离子提供的内能，etran为样品电离后母离子在离子传输过程中获得的内能，ecol为母离子在cid过程中获得的能量，可得到公式(1)。

eion＝esou+etran+ecol(1)

如果碰撞能量以及传输过程的条件均保持一致，改变不同的电离源，那么母离子在不同离子源中获得的总内能会不同，它们之间的内能差异即为两个离子源给母离子提供内能的差异，如公式(2)。定义为电喷雾电离(esi)源给母离子提供的内能，为电喷雾萃取电离(eesi)源给母离子提供的内能。

保持离子化条件以及传输条件一致，从零开始缓慢增加电喷雾电离串联质谱中的碰撞能量，设碰撞能量为时，电喷雾电离串联质谱离子化过程中母离子开始形成碎片离子，此时碎片离子的强度为缓慢增加电喷雾萃取电离串联质谱中的碰撞能量，使碎片离子的强度逐渐增加，当电喷雾萃取电离串联质谱离子化过程中形成对应碎片离子的强度时，对应的碰撞能量为那么这两个碰撞能量的差值即为两种离子源提供给母离子的内能差，如公式(3)：

要形成相同强度的同种碎片离子，母离子获得的总内能是一定的，则结合公式(2)和公式(3)可得到公式(4)：

进一步地，碰撞能量的计算公式为:

ecol＝nce×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500(5)

其中，nce为碰撞能量的设置值，(isolationcenter)为母离子的质荷比，(chargefactor)为电荷因子，如果带单电荷，则电荷因子取值为1。结合公式(3)～(5)可得到公式(6):

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500(6)

其中，nce²为电喷雾萃取电离串联质谱中碰撞能量为时的设置值，nce¹为电喷雾电离串联质谱中碰撞能量为时的设置值，

进一步地，碰撞能量的改变以1％为梯度增加。

由此，便可计算得到电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异，其值为11.5±0.2ev。

进一步地，所述方法使用采用碰撞诱导解离技术的电喷雾电离串联质谱和电喷雾萃取电离串联质谱。

本发明的有益效果如下：

1、本发明首次提出采用碰撞诱导解离(cid)技术，计算电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异，相对于源内cid技术，本发明采用的技术可以对母离子进行选择富集、活化、碰撞等，其他离子不会被活化、碰撞解离，有效避免了其它离子的干扰；

2、本发明采用碰撞诱导解离(cid)技术，母离子碎裂过程时间尺度短，形成碎片离子的速率较大，因而不会发生重排反应，可保证测量结果的准确性；

3、采用质谱中离子丰度行为差异对两种电离技术的内能差异进行实验测定，方法效率高，可快速测得内能差异结果；

4、原理简单、操作简便、计算过程简单，无需繁杂的计算过程；

5、结果准确，稳定性高，可靠性强。

附图说明

图1为罗丹明b分子结构示意图；

图2为罗丹明b母离子结构示意图；

图3(a)为罗丹明b的eesi-ms²图，(b)为罗丹明b的esi-ms²图；

图4(a)为母离子和碎片离子峰强度与碰撞能量之间的关系图，(b)为碎片离子与母离子峰强度比值与碰撞能量之间的关系图；

图5为低碰撞能量(1％～22％)条件下，esi-ms²(a)和eesi-ms²(b)中碎片离子m/z413峰绝对强度的变化趋势图；

图6为低碰撞能量(1％～22％)条件下，esi-ms²(a)和eesi-ms²(b)中碎片离子m/z415峰绝对强度的变化趋势图；

图7为低碰撞能量(1％～22％)条件下，esi-ms²(a)和eesi-ms²(b)中碎片离子m/z399峰绝对强度的变化趋势图；

图8为精氨酸分子结构示意图；

图9为克伦特罗分子结构示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种测定电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子内能差异的方法，方法如下：使用串联质谱，分别通过电喷雾电离和电喷雾萃取电离两种离子源使样品溶液中的目标分子离子化形成一价正离子母离子，在毛细管传输作用下进入离子阱，经碰撞诱导解离技术得到丰富的碎片离子；上述过程中保持电喷雾电离和电喷雾萃取电离的传输条件与碰撞条件一致，改变离子阱中的碰撞能量，使母离子碰撞诱导解离，在电喷雾电离串联质谱和电喷雾萃取电离串联质谱两种模式下，分别调控碰撞诱导解离能量使所得到同种碎片离子的强度相等时，所述碰撞诱导解离过程中的能量差异即为一价正离子所获得的内能差异。

在串级质谱分析过程中，被电场加速的高能离子必须与碰撞气体分子发生碰撞才可以将离子的动能转化为离子内部的能量；高内能的离子进一步发生化学键的断裂生成碎片离子。因此，串联质谱中，影响离子的内能变化主要包括三部分，即离子化过程的能量，离子传输过程的能量和离子阱中的碰撞能量。理论上，同一物质(保持浓度、溶剂等参数不变)在离子传输过程中，获得的能量相同。同一物质在相同的碰撞能量条件下，获得的能量也相同。要形成相同强度的碎片离子，母离子获得的总内能是一定的。那么保持离子化条件和离子传输条件一致，仅改变离子阱中的碰撞能量，碎片离子峰强度会有明显差异，即得到的碎片离子丰度差异非常明显，而导致产生碎片离子丰度差异的原因在于离子化过程的能量差异，即是由于eesi与esi传递给目标分子之间的内能差异。因此可以通过测定一价正离子碰撞诱导解离过程中的能量差异，来计算一价正离子所获得的内能差异。

进一步地，从零开始增加碰撞能量，当所述电喷雾萃取电离所获母离子碰撞诱导解离后得到的碎片离子的强度等于电喷雾电离所获母离子碰撞诱导解离后开始得到的碎片离子的强度时，两个碰撞能量的差值即为所述两种离子源提供给母离子的内能差异。

进一步地，所述碰撞能量取值为0％～100％。

进一步地，所述内能差异的计算方法如下：

定义eion为母离子获得的总内能，esou为离子源给母离子提供的内能，etran为样品电离后母离子在离子传输过程中获得的内能，ecol为母离子在cid过程中获得的能量，可得到公式(1)。

eion＝esou+etran+ecol(1)

如果碰撞能量以及传输过程的条件均保持一致，改变不同的电离源，那么母离子在不同离子源中获得的总内能会不同，它们之间的内能差异即为两个离子源给母离子提供内能的差异，如公式(2)。定义为电喷雾电离(esi)源给母离子提供的内能，为电喷雾萃取电离(eesi)源给母离子提供的内能。

保持离子化条件以及传输条件一致，从零开始缓慢增加电喷雾电离串联质谱(esi-ms²)中的碰撞能量，设碰撞能量为时，esi-ms²离子化过程中母离子开始形成碎片离子，此时碎片离子的强度为缓慢增加电喷雾萃取电离串联质谱(eesi-ms²)中的碰撞能量，使碎片离子的强度逐渐增加，当eesi-ms²过程中形成对应碎片离子的强度时，eesi-ms²中对应的碰撞能量为那么这两个碰撞能量的差值即为两种离子源提供给母离子的内能差，如公式(3)：

要形成相同强度的同种碎片离子，母离子获得的总内能是一定的，则结合公式(2)和公式(3)可得到公式(4)：

进一步地，根据thermo厂商提供的碰撞能量与归一化碰撞能量之间的换算公式，如公式(5):

ecol＝nce×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500(5)

其中，nce为碰撞能量的设置值，(isolationcenter)为母离子的质荷比，(chargefactor)为电荷因子，如果带单电荷，则电荷因子取值为1。结合公式(3)～(5)可得到公式(6):

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500(6)

其中，nce²为eesi-ms²中碰撞能量为时的设置值，nce¹为esi-ms²中碰撞能量为时的设置值，

进一步地，碰撞能量的改变以1％为梯度增加。

由此，便可计算得到电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异，其值为11.5±0.2ev。

进一步地，所述方法使用采用碰撞诱导解离技术的电喷雾电离串联质谱和电喷雾萃取电离串联质谱。

下面将结合本发明的实施例中的附图，对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所使用的仪器与装置：

eesi和esi离子源均由实验室自行研制搭建；

ltq-xl线性离子阱质谱仪，配有xcalibur型数据处理系统(美国finnigan公司)。

主要材料与试剂：

ar气(纯度＞99.999％，江西国腾气体有限公司)；

罗丹明b(97％)，购于百灵威公司(上海)；

精氨酸(99％)，购于百灵威公司(上海)；

克伦特罗，购于百灵威公司(上海)；

甲醇为hplc级别，购于sigma-aldrich公司(美国)。

实验过程：

分别搭建eesi-ms和esi-ms装置平台，通过调控cid的能量，进行串联质谱分析。线性离子阱质谱(ltq-ms)采用正离子检测模式，质谱扫描范围m/z50～600，esi使用的溶剂与eesi使用的萃取剂均为水，流速1μl/min，喷雾电压4.0kv，喷雾气(n2)压1.0mpa，透镜电压30v，毛细管温度150℃，毛细管锥孔电压12v。在进行串联质谱分析时，母离子的隔离窗口宽度设定为1.0u，碰撞时间为30ms，碰撞能量为0％～100％，其它参数由ltq-tune软件系统自动优化使母离子的信号强度达到最佳。在进行esi-ms和eesi-ms实验时，精密调节流量、流速等条件，使两种离子源的各项参数保持一致。

实施例1～3以罗丹明b为研究对象，测定电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异。如图1、图2所示，罗丹明b分子结构较大，存在共轭体系，而且本身带有正电荷，容易电离形成离子。因此，罗丹明b为具有代表性的一价正离子研究对象，结果精确度高。

实施例1：

分别搭建eesi-ms和esi-ms装置平台，通过调控cid的能量，对罗丹明b进行串联质谱分析，在正离子模式下形成的母离子质荷比是m/z443，得到罗丹明b的eesi-ms²图和esi-ms²图。图3(a)是罗丹明b的eesi-ms²图，当碰撞能量为30％时，母离子m/z443主要分别丢失c2h4、c2h6和co2中性分子，产生m/z415、m/z413和m/z399碎片离子。在相同的碰撞能量条件下，采用esi-ms²对罗丹明b进行实验，结果如图3(b)所示，也可获得m/z415，m/z413和m/z399碎片离子，这些碎片离子与eesi-ms²的结果是一致的。然而，对比图3(a)和图3(b)可以发现，在esi-ms中，碎片离子的相对丰度明显较eesi-ms中的高，说明采用esi对罗丹明b进行电离比采用eesi电离其准分子离子峰m/z443碎裂的更彻底，从而证明eesi是一种比esi更软的电离方式。影响离子的内能变化主要包括三部分，即离子化过程的能量，离子传输过程的能量和离子阱中的碰撞能量。保持离子化条件和离子传输条件一致，仅改变离子阱中的碰撞能量，碎片离子峰强度会有明显差异。在本实验中，采用esi和eesi两种不同的电离方式，并使两种方式下离子传输条件与离子阱碰撞条件均保持一致，得到的碎片离子丰度差异非常明显。造成两者谱图差异是由于eesi与esi传递给目标分子之间的内能存在一定的差异性。

以碎片离子m/z413为例，采用本发明的方法来计算两种离子源的内能差异。图5为低碰撞能量(1％～22％)条件下，esi-ms²和eesi-ms²中碎片离子m/z413峰绝对强度的变化趋势图。在esi-ms²中，缓慢增加esi-ms²中的碰撞能量，当碰撞能量为时，母离子开始形成碎片离子，碰撞能量全部用于提供母离子内能，此时碎片离子m/z413的强度为(图5(a))。当继续增加碰撞能量时，碰撞过程中传递给罗丹明b分子的能量大部分用于降低分子共轭体系的能量，少部分用来解离形成碎片，当碰撞能量增大到一定值(远大于分子的键解离能)时，碎片离子的强度会显著增加，此时的能量主要用于解离形成碎片离子。而在eesi-ms²中(图5(b))，缓慢增加eesi-ms²中的碰撞能量，使碎片离子的强度逐渐增加，当碰撞能量小于14％时，罗丹明b分子未被活化，碎片离子m/z413的强度即要使esi-ms²和eesi-ms²中碎片离子m/z413的峰强度相同对应的碰撞能量由公式(3)可知，两者串联质谱中的碰撞能量之差为：

结合公式(4)可知，13％的碰撞能量即为两种离子源的内能差。由公式(6)可得：

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500＝(14-1)×443×1÷500＝11.5ev

即电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异为11.5ev。

实施例2：

以碎片离子m/z415为例，采用本发明的方法来计算两种离子源的内能差异。图6为低碰撞能量(1％～22％)条件下，esi-ms²和eesi-ms²中碎片离子m/z415峰绝对强度的变化趋势图。在esi-ms²中，缓慢增加esi-ms²中的碰撞能量，当碰撞能量％时，母离子开始形成碎片离子，此时碎片离子m/z415的强度为在eesi-ms²中，要使碎片离子m/z415的峰强度对应的碰撞能量由公式(3)可知，两者串联质谱中的碰撞能量之差为：

结合公式(4)可知，13％的碰撞能量为两种离子源的内能差。由公式(6)计算两种电离源所获一价正离子内能差异为11.5ev，计算过程如下：

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500＝(14-1)×443×1÷500＝11.5ev

实施例3：

以碎片离子m/z399为例，采用本发明的方法来计算两种离子源的内能差异。图7为低碰撞能量(1％～22％)条件下，esi-ms²和eesi-ms²中碎片离子m/z399峰绝对强度的变化趋势图。在esi-ms²中，当碰撞能量为时，母离子开始形成碎片离子，此时碎片离子m/z399的强度为在eesi-ms²中，要使碎片离子m/z399的峰强度对应的碰撞能量由公式(3)可知，两者串联质谱中的碰撞能量之差为：

结合公式(4)可知，13％的碰撞能量为两种离子源的内能差。由公式(6)可得：

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500＝(14-1)×443×1÷500＝11.5ev

即内能差异为11.5ev。

实施例4：

如图8所示，本实施例以精氨酸为研究对象。精氨酸的分子量是174，在正离子模式下形成的母离子质荷比是m/z175，在cid条件下会发生碎裂，形成碎片离子m/z157。在esi-ms²中，缓慢增加碰撞能量，当碰撞能量为时，碎片离子m/z157的峰强度在eesi-ms²中，当碰撞能量逐渐升高至34％时，碎片离子m/z157的峰强度才达到77.2左右，即两者峰强度一致时，所需要的碰撞能量差为：因此，根据公式(6)计算可知：

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500＝(34-1)×175×1÷500＝11.6ev

即电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异11.6ev。

实施例5：

如图9所示，本实施例以克伦特罗为研究对象。克伦特罗的分子量是277，在正离子模式下形成的母离子质荷比是m/z278，在cid条件下会发生碎裂，形成碎片离子m/z259。在esi-ms²中，缓慢增加碰撞能量，当碰撞能量为时，碎片离子m/z259的峰强度在eesi-ms²中，当碰撞能量逐渐升高至22％时，碎片离子m/z259的峰强度才达到3370左右，即两者峰强度一致时，所需要的碰撞能量差为：因此，根据公式(6)计算可知：

δeion＝(nce²-nce¹)×(isolationcenter)×(chargefactor)÷500＝(22-1)×278×1÷500＝11.7ev

即电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子的内能差异11.7ev。

如表1为实施例1～5的实验数据对比表，由表中数据可知，根据本发明的方法对不同物质、不同碎片离子的强度变化进行计算，均得到一致的结果。因此，采用本发明的方法计算电喷雾电离和电喷雾萃取电离所获一价正离子内能差异的结果可靠，且内能差异为11.5±0.2ev。

表1

综上所述，本发明采用质谱中离子丰度行为差异对两种软电离技术eesi和esi的内能差异进行了实验测定，其测定值为11.5±0.2ev。该方法原理简单、操作简便、且无需繁杂的计算过程。本方法不仅可为不同离子源内能差异的比较提供了参考依据，也为深刻理解不同离子源产生离子的质谱行为提供参考。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。