本发明涉及抗菌剂检测技术领域，尤其涉及一种三氯生磺酸铵及其制备方法与应用。
背景技术
三氯生(triclosan，tcs)，化学名称为5-氯-2-(2,4-二氯苯氧基)苯酚(5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol)，是一种广谱高效抗菌剂，自20世纪70年代起，被广泛添加于牙膏、肥皂、洗发水、护肤霜、洗涤液等个人护理产品和家庭日用品中，其含量为0.1–0.3wt％。由于其应用范围广、用量大，三氯生已在全球范围内多种环境介质及生物体中检出。
人体可以通过摄食和皮肤接触的途径暴露三氯生。人体的尿液、血清、血浆和母乳中均有三氯生检出；此外，孕妇血清中的三氯生还可以跨越胎盘屏障经脐带血暴露至胎儿。随着相关研究的日益深入，三氯生的生物毒性效应也逐渐被人们所认识。三氯生的潜在毒性效应包括内分泌干扰、肝脏毒性、基因毒性、甲状腺功能受损、发育障碍、氧化应激等。三氯生进入人体后同时能够发生代谢反应，主要通过磺酸化反应和葡糖醛酸化反应将亲脂性的三氯生转化为极性更强、水溶性更好的ii相代谢产物三氯生磺酸(triclosansulfate,tcss)和三氯生葡糖醛酸(triclosanglucuronidate,tcsg)，然后经尿液和粪便排出体外。因此，研究三氯生在生物体内的代谢过程对于全面评估三氯生的生物毒性具有重要的意义。但是，由于商品化的三氯生ii相代谢产物标准品的缺乏，许多研究将三氯生结合产物用酶水解后对三氯生的总量进行评价，这种做法是一种国际上通用的权宜之计，但却无法准确揭示三氯生在生物体内的迁移转化过程。
目前国际上仅有两篇关于三氯生磺酸的合成方法的报道，且制得的产物仅能用来定性样品中的三氯生磺酸，未能达到准确定量的要求。其中，生物合成法的制备过程复杂且产率低；化学合成法使用的反应溶剂毒性较大，对反应温度的要求较高，且分离纯化过程使用半制备液相色谱仪，分离时间长且效率低，最重要的是，半制备液相色谱流动相中引入了过量的醋酸铵，使三氯生磺酸的纯度无法满足定量的要求。此外，三氯生磺酸不能以固态稳定存在，这加剧了其作为标准品对样品中的三氯生磺酸准确定量的困难，因而，制备固态三氯生磺酸盐类成为解决这一问题的重要途径。但三氯生磺酸钠、三氯生磺酸钾等盐类的合成过程中容易引入过量的钠离子和钾离子无法彻底去除。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种三氯生磺酸铵及其制备方法与应用，旨在解决现有检测三氯生磺酸的标准品三氯生磺酸因不能以固态稳定存在，三氯生磺酸钠或三氯生磺酸钾因在合成过程中易引入过量的钠离子或钾离子无法彻底去除从而导致纯度不够而不能对样品中三氯生磺酸进行准确定量的问题。
本发明的技术方案如下：
一种三氯生磺酸铵，其中，所述三氯生磺酸铵的结构式为
一种如上所述的三氯生磺酸铵的制备方法，其中，包括：
步骤a、将质量比为1:2-4的三氯生和三氧化硫吡啶络合物加入溶剂中，在温度为15-40℃的条件下搅拌反应，得到三氯生磺酸反应液；
步骤b、将三氯生磺酸反应液减压浓缩，经纯化处理，得到纯化的三氯生磺酸溶液；
步骤c、纯化的三氯生磺酸溶液与过量的氨水进行反应，经浓缩、冷冻干燥，得到三氯生磺酸铵。
所述的三氯生磺酸铵的制备方法，其中，步骤a中，所述溶剂为n,n-二甲基甲酰胺。
所述的三氯生磺酸铵的制备方法，其中，步骤b中，纯化处理的过程具体包括：
步骤b1、依次用甲醇、水对固相萃取柱进行活化，接着将浓缩过的三氯生磺酸反应液加入活化过的固相萃取柱中；
步骤b2、依次用体积比为1:9、3:7、1:1的甲醇-水混合溶剂对固相萃取柱进行淋洗，接着用体积比为7:3的甲醇-水混合溶剂对固相萃取柱液进行洗脱，最后用甲醇对固相萃取柱进行清洗；
步骤b3、将体积比为7:3的甲醇-水混合洗脱液减压浓缩，将浓缩过的体积比为7:3的甲醇-水混合洗脱液加入活化过的固相萃取柱中，重复步骤b2进行进一步纯化，进一步纯化后得到的7:3的甲醇-水混合洗脱液即为纯化的三氯生磺酸溶液。
所述的三氯生磺酸铵的制备方法，其中，步骤c具体包括：纯化的三氯生磺酸溶液与过量的氨水进行反应，得到三氯生磺酸铵反应液，减压浓缩，接着将浓缩过的三氯生磺酸铵反应液冷冻干燥，得到固态化合物三氯生磺酸铵。
所述的三氯生磺酸铵的制备方法，其中，步骤b1中，所述固相萃取柱的规格为generikh2p固相萃取柱，75ml，10g。
一种生物样品中的三氯生磺酸的检测方法，其中，以如上所述的三氯生磺酸铵为标准品，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪对生物样品中的三氯生磺酸进行检测。
所述的生物样品中的三氯生磺酸的检测方法，其中，所述超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪包括超高效液相色谱系统和质谱系统；
所述超高效液相色谱系统的参数包括：acquityuplcbehc18色谱柱，规格为1.7μm，100mm×2.1mm，waters；流动相包括乙腈和2mm的醋酸铵水溶液，流速为0.30ml·min–1；柱温为35℃；进样量为10μl；
所述质谱系统的参数包括：电离方式为电喷雾负离子化模式，数据采集模式为多反应监测模式，喷雾电压2600v，离子传输管温度350℃，喷雾器温度300℃。
所述的生物样品中的三氯生磺酸的检测方法，其中，以3.61min为所述三氯生磺酸的色谱保留时间，以m/z368.89→268.89和m/z366.89→266.89为所述三氯生磺酸的监测离子对，对生物样品的三氯生磺酸进行定性检测。
所述的生物样品中的三氯生磺酸的检测方法，其中，以m/z366.89→266.89为所述三氯生磺酸的定量用监测离子对，以色谱峰的峰面积对生物样品中三氯生磺酸进行定量检测，以标准曲线法计算获得定量检测结果。
有益效果：本发明的三氯生磺酸铵能够以固态形式稳定存在，代替三氯生磺酸作为检测生物样品中三氯生磺酸的标准品，能够满足准确定量检测的要求，且检测的灵敏度高，为研究三氯生在生物体内的迁移转化及引起生物毒性的机理奠定了基础。本发明的三氯生磺酸铵的制备方法具有合成路线短，反应装置简单，采用固相萃取法对产物进行分离和纯化，操作方便快捷等优点，得到的铵盐稳定性强、纯度高。
附图说明
图1为本发明实施例1步骤(1)得到三氯生磺酸反应液在fullms模式下测得的色谱-质谱图(a)和在prm模式下测得的色谱-质谱图(b)。
图2为本发明实施例1步骤(2)中第一次固相萃取分离后的淋洗液、洗脱液和清洗液在fullms模式下测得的色谱图。
图3为本发明实施例1步骤(2)中第二次固相萃取纯化后的洗脱液和清洗液在fullms模式下测得的色谱图。
图4为本发明实施例1步骤(3)得到的终产物的核磁共振氢谱图。
图5为本发明实施例1步骤(3)得到的终产物在fullms模式下测得的色谱-质谱图。
图6为本发明实施例2中对照组的生物样品在mrm模式下测得的色谱图(a)和暴露组的生物样品在mrm模式下测得的色谱图(b)。
具体实施方式
本发明提供一种三氯生磺酸铵及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种三氯生磺酸铵，其中，所述三氯生磺酸铵的结构式为
本发明的三氯生磺酸铵能够以固态形式稳定存在，代替三氯生磺酸作为检测生物样品中三氯生磺酸的标准品，能够满足准确定量检测的要求，且检测的灵敏度高，为研究三氯生在生物体内的迁移转化及引起生物毒性的机理奠定了基础。
一种如上所述的三氯生磺酸铵的制备方法的较佳实施例，其中，包括：
步骤a、将质量比为1:2-4(优选1:2-3)的三氯生和三氧化硫吡啶络合物加入溶剂(优选n,n-二甲基甲酰胺)中，在温度为15-40℃(优选25℃–35℃)的条件下搅拌反应，得到三氯生磺酸反应液；
步骤b、将三氯生磺酸反应液减压浓缩至1-5ml(优选2-4ml)，经纯化处理，得到纯化的三氯生磺酸溶液；
步骤c、纯化的三氯生磺酸溶液与过量的氨水进行反应，经浓缩、冷冻干燥，得到三氯生磺酸铵。
所述的三氯生磺酸铵的制备方法，其中，步骤b中，纯化处理的过程具体包括具体包括：
步骤b1、依次用甲醇、水对固相萃取柱进行活化，接着将浓缩过的三氯生磺酸反应液加入活化过的固相萃取柱中；优选地，所述固相萃取柱的规格为generikh2p固相萃取柱，75ml，10g；
步骤b2、依次用体积比为1:9、3:7、1:1的甲醇-水混合溶剂对固相萃取柱进行淋洗，接着用体积比为7:3的甲醇-水混合溶剂对固相萃取柱进行洗脱，最后用甲醇对固相萃取柱进行清洗；
步骤b3、将体积比为7:3的甲醇-水混合洗脱液在45℃下减压浓缩至2-6ml(优选3-5ml)，将浓缩过的体积比为7:3的甲醇-水混合洗脱液加入活化过的固相萃取柱中，重复步骤b2进行进一步纯化，进一步纯化后得到的7:3的甲醇-水混合洗脱液即为纯化的三氯生磺酸溶液。
步骤c具体包括：纯化的三氯生磺酸溶液与过量的氨水进行反应，得到三氯生磺酸铵反应液，减压浓缩至1-4ml，接着将浓缩过的三氯生磺酸铵反应液冷冻干燥，得到固态化合物三氯生磺酸铵。
本发明上述三氯生磺酸铵的制备方法具有合成路线短，反应装置简单，采用固相萃取法对产物进行分离和纯化，操作方便快捷等优点，得到的铵盐稳定性强、纯度高。
本发明提供的一种生物样品中的三氯生磺酸的检测方法的较佳实施例，其中，以如上所述的三氯生磺酸铵为标准品，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪对生物样品中的三氯生磺酸进行检测。
具体地，所述超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪包括超高效液相色谱系统和质谱系统；
所述超高效液相色谱系统的参数包括：acquityuplcbehc18色谱柱，规格为1.7μm，100mm×2.1mm，waters；流动相包括乙腈和2mm的醋酸铵水溶液，流速为0.30ml·min–1；柱温为35℃；进样量为10μl；
所述质谱系统的参数包括：电离方式为电喷雾负离子化模式(esi-)，数据采集模式为多反应监测模式(mrm)，喷雾电压2600v，离子传输管温度350℃，喷雾器温度300℃。
具体地，以3.61min为所述三氯生磺酸的色谱保留时间，以m/z368.89→268.89和m/z366.89→266.89为所述三氯生磺酸的监测离子对，对生物样品的三氯生磺酸进行定性检测。
具体地，以m/z366.89→266.89为所述三氯生磺酸的定量用监测离子对，以色谱峰的峰面积对生物样品中三氯生磺酸进行定量检测，以标准曲线法计算获得定量检测结果；所述色谱峰是指与所述三氯生磺酸的色谱保留时间对应的色谱峰。
本发明以三氯生磺酸铵作为标准品对生物样品中的三氯生磺酸的检测方法，能够满足准确定量检测的要求，且检测的灵敏度高，为研究三氯生在生物体内的迁移转化及引起生物毒性的机理奠定了基础。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1三氯生磺酸铵的制备
(1)三氯生磺酸反应液的制备，合成三氯生磺酸的反应式为
在单口瓶中投入三氯生50mg，三氧化硫吡啶络合物100mg，加入n,n-二甲基甲酰胺(dmf)2ml，25℃下磁力搅拌反应24h，得到三氯生磺酸反应液。
取少量的三氯生磺酸反应液用甲醇稀释至原有浓度的1/200，超高速离心(15,000rpm，10min)后，用超高效液相色谱(uplc)-qextractive组合型四极杆/轨道阱高分辨质谱仪(qe，thermofisherscientific，usa)对其进行鉴定。uplc超高效液相色谱系统，采用acquityuplcbehc18色谱柱(1.7μm，100mm×2.1mm，waters)，柱温：35℃，流速：0.30ml·min–1，进样量：10μl。流动相a为乙腈，b为含2mm醋酸铵的水相；洗脱梯度起始时20％a+80％b(v/v)作为流动相，持续1.0min；2.0min时80％a+20％b(v/v)作为流动相，并保持至6.0min；6.5min时100％a+0％b(v/v)作为流动相，并保持至7.5min；8.0min时恢复至初始状态20％a+80％b(v/v)作为流动相，并持续2.0min。qe质谱系统，采用负离子化模式，以及全扫描模式(fullms)下和平行反应监测模式(prm)(以35cl为例)下对三氯生磺酸反应液中各组分的结构进行鉴定，各组分在fullms下测得的色谱-质谱图如图1(a)所示，各组分在prm模式下测得的色谱-质谱图如图1(b)所示。结果显示，三氯生磺酸反应液含有生成的三氯生磺酸，三氯生磺酸的色谱保留时间为3.61min。
(2)纯化的三氯生磺酸溶液的制备：(a)将步骤1中的三氯生磺酸反应液减压浓缩至3ml，依次用100ml甲醇和100ml水对generikh2p固相萃取柱进行活化，将浓缩过的三氯生磺酸反应液加入活化过的generikh2p固相萃取柱；(b)依次用100ml10％、30％、50％甲醇/水(v/v)对generikh2p固相萃取柱进行淋洗，再用100ml70％甲醇/水(v/v)对对generikh2p固相萃取柱中的目标化合物进行洗脱，最后用100ml100％甲醇对generikh2p固相萃取柱进行清洗；(c)将上述70％甲醇/水(v/v)洗脱液在45℃减压旋蒸浓缩至约4–5ml，重复上述步骤(b)，用generikh2p固相萃取柱对浓缩过的70％甲醇/水(v/v)洗脱液进行进一步纯化，制得纯化的三氯生磺酸溶液。
取(b)分离过程的各淋洗液、洗脱液和清洗液，超高速离心(15,000rpm，10min)后，按以上方法用uplc-qe质谱在fullms模式下进行分析，分离过程中的淋洗液、洗脱液和清洗液在fullms模式下测得的色谱图如图2所示。结果显示，三氯生磺酸主要存在于70％甲醇/水的洗脱液中，含有的主要杂质为原料三氯生；根据其峰面积，计算得到三氯生磺酸的纯度为96.2％。取(c)分离过程中的70％甲醇/水(v/v)洗脱液和100％甲醇清洗液，超高速离心(15,000rpm，10min)后，按以上方法用uplc-qe质谱在fullms模式下进行分析，分离过程中的70％甲醇/水(v/v)洗脱液和100％甲醇清洗液在fullms模式下测得的色谱图如图3所示。结果显示，70％甲醇/水(v/v)洗脱液中三氯生磺酸的纯度＞99％，则进一步纯化后的70％甲醇/水(v/v)洗脱液即为纯化的三氯生磺酸溶液。
需特别指出的是，三氯生磺酸无法以固态形式稳定存在，若将洗脱液直接作干燥处理，三氯生磺酸将完全转化为原料三氯生。
(3)三氯生磺酸铵的制备，合成三氯生磺酸铵的反应式为
向纯化的三氯生磺酸溶液中加入8ml氨水，充分混匀后，在45℃减压旋蒸浓缩至1ml，将浓缩液在-50℃下冷冻减压干燥，在冷冻减压干燥过程中，过量的氨水将以气态形式完全被除去，得到的终产物为固体。
以methanol-d4为溶剂，测定终产物的核磁共振氢谱，终产物的核磁共振氢谱图如图4所示；1h-nmr(methanol–d4，400mhz)δ：7.70(d,1h)，7.51(d,1h)，7.22(dd,1h)，7.12(dd,1h)，6.87(t,2h)。用甲醇溶解终产物，在fullms模式下对终产物进行质谱检测，终产物在fullms模式下测得的色谱-质谱图如图5所示，结果与理论值相符。说明三氯生磺酸完全转化为铵盐而稳定存在。
实施例2生物样品中三氯生磺酸的检测
(1)优化三氯生磺酸的相关质谱参数
采用uplc-tsq三重四级杆串联质谱仪(thermofisherscientific，usa)建立三氯生磺酸的检测方法。uplc超高效液相色谱系统的条件同实施例1中所述；tsq质谱系统，采用电喷雾负离子化模式(esi-)，选择多反应监测模式(multiplereactionmonitoring，mrm)扫描，喷雾电压2600v，离子传输管温度350℃，喷雾器温度300℃。使用上述制备得到的三氯生磺酸铵，优化得到三氯生磺酸的监测离子对为m/z366.89→266.89(碰撞能量16ev)和m/z368.89→268.89(碰撞能量16ev)，可作为定性用监测离子对。其中，选择m/z366.89→266.89作为定量用监测离子对。
(2)准备生物样品
取处于对数生长期的人体正常肝细胞l02，加细胞培养液调节三氯生暴露剂量为1μmol·l–1。暴露48h后去除细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗细胞2遍，胰蛋白酶消化后离心(1000rpm，5min)，去除基质后，加入预冷的80％甲醇/水(含同位素内标tcs-d3)，液氮反复冻融细胞5次，离心(15,000rpm，10min，4℃)后得到待测细胞提取液，将上述得到待测细胞提取液作为暴露组的生物样品；同时设置不暴露三氯生的细胞提取液作为对照组的生物样品。
(3)对生物样品中三氯生磺酸进行检测
以本发明制得的三氯生磺酸铵作为标准品，检测条件同同本实施例的(1)中所述，以3.61min为三氯生磺酸的色谱保留保留时间；以m/z366.89→266.89和m/z368.89→268.89为三氯生磺酸的定性用监测离子对；以m/z366.89→266.89三氯生磺酸的定量用监测离子对；采用uplc-tsq三重四级杆串联质谱仪对暴露组和对照组的生物样品分别进行检测，对照组的生物样品在mrm模式下测的得色谱图如图6(a)所示，暴露组的生物样品在mrm模式下测得的色谱图如图6(b)所示。检测结果显示，在对照组的生物样品中未检出三氯生磺酸；在暴露组中的生物样品中检测到了三氯生磺酸的生成，以与色谱保留时间3.61min对应的色谱峰的峰面积定量暴露组的生物样品中三氯生磺酸的含量，并以标准曲线法计算获得三氯生磺酸的浓度为0.174μmol·l–1；三氯生的原有浓度为2.08μmol·l–1，则生物样品中三氯生磺酸的摩尔百分比为8.4％，说明细胞中的三氯生有磺酸化代谢反应的发生。
综上所述，本发明提供了一种三氯生磺酸铵及其制备方法与应用，本发明的三氯生磺酸铵能够以固态形式稳定存在，代替三氯生磺酸作为检测生物样品中三氯生磺酸的标准品，能够满足准确定量检测的要求，且检测的灵敏度高，为研究三氯生在生物体内的迁移转化及引起生物毒性的机理奠定了基础。本发明的三氯生磺酸铵的制备方法具有合成路线短，反应装置简单，采用固相萃取法对产物进行分离和纯化，操作方便快捷等优点，得到的铵盐稳定性强、纯度高。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。