脂蛋白胆固醇检测系统的制作方法

本发明属于体外诊断领域，具体说是一种用于检测血清样本中脂蛋白胆固醇图谱的仪器和试剂系统即脂蛋白胆固醇检测系统(用于检测脂蛋白亚组分的系统)。
背景技术：
众所周知，按照脂蛋白的密度不同，可以将脂蛋白分为乳糜微粒(cm)，极低密度脂蛋白(vldl)，中间密度脂蛋白(idl)，低密度脂蛋白(ldl)，和高密度脂蛋白(hdl)。临床上，通常测定各类脂蛋白的胆固醇含量，用于指导诊断。目前临床上常规测定的不仅有总胆固醇(t-ch)，还有ldl-c，hdl-c。其中ldl-c的含量过高容易导致动脉粥样硬化，俗称坏胆固醇，而hdl-c对血管具有一定的保护作用，俗称好胆固醇。但最近的研究表明，无论是ldl-c，还是hdl-c均具有异质性，其临床意义也不完全相同。如ldl-c可以分成许多亚组分，小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdldl-c)，由于其结构更加致密，更加容易引起动脉粥样硬化，也称为b型，而大而轻低密度脂蛋白胆固醇(lldl-c)则相比之下致动脉粥样硬化的能力较弱，又称为a型。在hdl-c中，也可以至少分为两种主要亚组分，如大而轻的hdl2颗粒，以及小而密的hdl3颗粒，一些研究证据已经显示测量hdl的亚组分比仅测量hdl能够更好地反应心血管疾病的风险。目前，常规的临床检测方法都只能检测一个或少数几个指标，能够同时检测多个指标，或者能够反应脂蛋白胆固醇分布的技术非常有限，并且基本停留在科研阶段，真正实现临床应用的并不多。其中电泳法是发展比较早的一门技术，在脂蛋白的检测中经常用到，首先经过电泳分离脂蛋白后，再用相应的方法染色，如染色脂蛋白，也有染色胆固醇的，在通过扫描将数据收集分析。该方法由于中间步骤繁琐，电泳分离精度和染色扫描等步骤的精度问题，使得该方法的精密度和准确度有待考量。另一种方法是核磁共振法，但是该法的技术门槛较高，不仅仪器昂贵，且对操作人员的要求高，故而该方法更加适合于科研用途，而在临床检验中推广有一定的难度。相比之下，美国专利us5284773，us5633168公开了(verticalautoprofile)一种检测技术，该技术在精密度、准确度等方面均有一定的优势。该技术是利用超速离心分离脂蛋白，再用vap仪器检测连续的脂蛋白胆固醇，进而得出脂蛋白胆固醇谱图，计算各个组分的脂蛋白胆固醇含量。由于该技术利用了垂直转子，使得离心时间大大缩短，且所需的样本量为50ul。但是该技术仍然存在着一定的缺陷，比如由于是使用的是胆固醇单试剂，使得样本跟试剂一接触就反应，若样本中有干扰物质也将直接与该反应相互作用，导致抗干扰能力比较差，进而影响检测结果，且由于单试剂中用的色原物质的摩尔吸光度较低，导致灵敏度有限。技术实现要素：本发明针对现有技术的上述不足，提供一种脂蛋白胆固醇检测系统，该检测系统具有更高的灵敏度，且提高了抗干扰能力，并且不限于检测常规的样本。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种脂蛋白胆固醇检测系统，该系统包括样本容器、第一试剂容器、第二试剂容器、冲洗容器，第一反应模块，第二反应模块和检测模块；所述的样本容器和第一试剂容器通过管道并联于第一反应模块的进口管道上，所述的冲洗容器通过管道连接于样本容器与第一反应模块连接的管道上；所述的第一反应模块的出口与第二反应模块的进口通过管道连接，所述的第二试剂容器通过管道连接于第一反应模块与第二反应模块相连接的管道上；所述的第二反应模块的出口端连接检测模块。作为优选，所述的样本容器的出口管道上设置有第一控制阀和传感器，所述的传感器用于检测样本是否流完，所述的第一控制阀用于控制出口管道的开合，当所述的传感器检测到样本流完所述的第一控制阀关闭、当所述的传感器检测到样本存在则控制第一控制阀开启。作为优选，所述的冲洗容器出口端连接的管道上设置有第二控制阀，当所述的第一控制阀关闭时所述的第二控制阀打开以使得清洗液对管路进行清洗。作为优选，所述的样本容器与冲洗容器的连接处设置有第一三通阀，所述的样本容器、第一试剂容器和第一反应模块的连接处设置有第二三通阀，所述的第二试剂容器、第一反应模块和第二反应模块的连接处设置有第三三通阀。作为优选，所述的第一试剂容器的出口管道上设置有第一泵体，所述的第二试剂容器的出口管道上设置有第二泵体。作为优选，所述的第一反应模块为具有一定长度的管路，且具有温控功能；采用该结构，液体流经该模块时，可以孵育一定的时间，使反应进行，同时具有温控功能如通过水浴、金属浴、气浴等控制温度，温度的控制有利于反应在较适合的条件下进行，且可以使得每个样本反应在相同的条件下进行。优选的，所述第一反应模块的管道长度为0.25m-10m，优选0.5m-5m，更优选1m-2.5m，最优选1.5m。作为优选，所述的第二反应模块为具有一定长度的管路，且具有温控功能；采用该结构，液体流经该模块时，可以孵育一定的时间，使反应进行，同时具有温控功能如水浴、金属浴、气浴等控制温度，温度的控制有利于反应在较适合的条件下进行，且可以使得每个样本反应在相同的条件下进行。优选的，所述第二反应模块的管道长度为0.25m-10m，优选0.5m-5m，更优选1m-2.5m，最优选1.5m。作为优选，所述的检测模块的出口端的管路上连接有第三泵体和废液收集罐，且检测模块还电连接有记录模块和存储设备。采用上述结构，从检测模块出来的材料被废液收集罐及时的收集，不会对环境造成污染和破坏；而记录模块可以直接记录检测的结果，并进行打印，而存储设备可以将数据进行保存。作为优选，所述的第一试剂容器用于存放试剂r1，所述的试剂r1主要成分是表面活性剂lutensolap8(如上海泰金国家贸易公司销售的烷基酚乙氧基化合物，其中的lutensolap系列)和曲拉通x-100、4-aap(4氨基氨替比林)、抗坏血酸氧化酶等；所述的第二试剂容器用于存放试剂r2；试剂r2主要成分是胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶、toos等。作为进一步优选，所述的试剂r1主要成分的含量为：lutensolap8的浓度为0.01％-5％(质量百分含量)，曲拉通x-100的浓度为0.01％-5％(质量百分含量)，4-aap的浓度为0.1mm-10mm，抗坏血酸氧化酶的浓度为0.1ku/l-20ku/l。进一步的，所述的试剂r1主要成分为，lutensolap8的浓度为0.05％-1％，曲拉通x-100的浓度为0.05％-1％，4-aap的浓度为0.5mm-5mm，抗坏血酸氧化酶的浓度为0.5ku/l-10ku/l。进一步的，所述的试剂r1主要成分为，lutensolap8的浓度为0.1％-0.5％，曲拉通x-100的浓度为0.1％-0.5％，4-aap的浓度为1mm-2mm，抗坏血酸氧化酶的浓度为1ku/l-5ku/l。进一步的，所述的试剂r1主要成分为，lutensolap8的浓度为0.1％，曲拉通x-100的浓度为1.0％，4-aap的浓度为1mm，抗坏血酸氧化酶的浓度为2ku/l。作为进一步优选，所述试剂r2主要成分的含量为：胆固醇氧化酶的浓度为0.1-20ku/l，胆固醇酯酶的浓度为0.1-20ku/l，过氧化物酶的浓度为0.1-20ku/l，toos的浓度为0.1mm-10mm。进一步的，所述试剂r2主要成分的含量为，胆固醇氧化酶的浓度为0.5-10ku/l，胆固醇酯酶的浓度为0.5-10ku/l，过氧化物酶的浓度为0.5-10ku/l，toos的浓度为0.5mm-5mm。进一步的，所述试剂r2主要成分的含量为，胆固醇氧化酶的浓度为1-5ku/l，胆固醇酯酶的浓度为1-5ku/l，过氧化物酶的浓度为1-5ku/l，toos的浓度为1mm-2mm。进一步的，所述试剂r2主要成分的含量为，胆固醇氧化酶的浓度为2ku/l，胆固醇酯酶的浓度为2ku/l，过氧化物酶的浓度为2ku/l，toos的浓度为2mm。此外，在具体的试剂配制过程，还可以添加缓冲液，防腐剂等等，获得的试剂更加稳定，如缓冲液可以采用磷酸缓冲液(pb)等，防腐剂可以采用叠氮钠等。本发明的主要作用原理和流程如图1所示：经过超速离心分离后的样本，从图1中的样本容器的底部进入仪器，同时收到传感器的检测，一旦样本流干，第一控制阀就会闭合，使空气不会进入仪器的管路系统内。传感器和第一控制阀由控制器进行控制；当有样本在进行检测时，第一控制阀是处于打开状态，可以使样本进入管路，当一个样本进样完毕后，第一控制阀关闭，第二控制阀打开，位于清洗容器内清洗溶液如生理盐水进入管路，对管路进行清洗，以备下一个样本的检测做准备。当清洗完毕时，且下一个样本准备就绪后，第二控制阀关闭，第一控制阀打开，进行下一个样本的检测。本发明的优点和有意效果：1.本发明的系统，其中第一试剂容器内含有试剂r1，在第一泵体的作用下，以一定的流速进入仪器的管路内，并在第二三通阀处与样本混合，同时第二三通阀还能起到样本试剂混合作用。当试剂与样本混合后，再进入第一反应模块，第一反应模块可以是一个具有一定长度的管路，液体流经该模块时，可以孵育一定的时间，使反应进行，同时具有温控功能如水浴、金属浴、气浴等，温度的控制有利于反应在较适合的条件下进行，且可以使得每个样本反应在相同的条件下进行。2.本发明的系统，其中第二试剂容器内的试剂r2在第二泵体的作用下，进入仪器管路内，并在第三三通阀处与从第一反应模块出来的液体混合，该三通阀同时起到两个管路内试剂混合的作用。混合后的液体流向第二反应模块，第二反应模块可以是一个具有一定长度的管路，液体流经该模块时，可以孵育一定的时间，使反应进行，同时具有温控功能如水浴、金属浴、气浴等，温度的控制有利于反应在较适合的条件下进行，且可以使得每个样本反应在相同的条件下进行。3.本发明的系统，其中第二反应模块之后的是检测模块，通常检测模块可以是分光光度计，其能够检测从第二反应模块流过来的试剂的吸光度，所检测的吸光度被记录模块记录，并存储于电脑中，用于进一步的分析计算。第三泵体位于检测模块后，能够将检测后的试剂排除到其后面的废液收集罐中。同时第三泵体还具有控制整个液路的作用，与第一泵体、第二泵体、第一控制阀、第二控制阀共同作用，使整个液路从样本和试剂处按顺序流向反应模块和检测模块，能够防止液路倒流。4.本发明相比较与原仪器系统，增加了第二试剂容器，第二泵体，以及第一反应模块，同时也把原先的胆固醇单试剂更换成了胆固醇双试剂r1和r2。r1主要成分是表面活性剂lutensolap8和曲拉通x-100、4-aap、抗换血酸氧化酶等，r2主要成分是胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶、toos等。本发明的这种创新特点使得样本与试剂r1混合后在第一反应模块中有一定的反应时间，这样有利于去除样本中的干扰物质，使得这些干扰物质对后面的反应影响达到最小。当试剂r2再与经过一定去干扰反应的样本和试剂r1混合物混合时，其所反应产生的信号为样本中待检测物质的信号，不受其它杂质的干扰。举例来说，随着人们生活水平的提高，通常会补充各种营养物质，比如维生素类的，其中维生素c是一类具有还原性的物质，当患者服用了这类物质时，血清中就会出现维生素c，它能够使胆固醇试剂与样本反应所产生的过氧化氢还原掉，从而使得过氧化氢的含量减少，进一步地，偶联反应所产生的有色物质也减少，故使得所检测到的值明显偏低。这种影响对于检测结果的影响非常严重，应该引起足够的重视。然而本发明的系统却可以避免这种现象，因为在r1中添加了抗坏血酸氧化酶，经过r1和样本在第一反应模块中一定时间的孵育，维生素c能够被抗坏血酸氧化酶所氧化分解，生成的产物不具有还原性，使得整个反应不会被干扰，让检测结果更为准备。5.对于现有技术的单试剂而言，所有反应必须的原料都只能在一个试剂中，即使某些物质混合在一起容易发生变色、降解等，也没有良好的解决方案。如胆固醇试剂中的显色物质4-aap和苯酚，两者都是显色反应所必需的，但是长时间在一个溶液中，溶液发生氧化自显色，稳定性较差。由于本发明使用了双试剂系统，可以将不稳定的物质分别配制在r1试剂或r2试剂中，试剂的稳定性可以大幅提高。同时由于该试剂可以分开考虑不稳定的物质，将苯酚替换成另一种色原物质toos，该物质的摩尔吸光系数比苯酚所形成的有色物质的摩尔吸光系数大许多，故整个系统的灵敏度也将大大提高。即本发明的系统为双试剂即先用试剂r1与样本混合在第一反应室中反应一段时间，再与试剂r2混合在第二反应室中再反应一段时间，然后再通过检测器进行检测。这样使得本发明能够在试剂r1中添加某些组分后，在第一反应室中有充分的时间与样本作用，进而去除样本中的干扰物质对检测的影响，如添加抗坏血酸氧化酶，去除样本中维生素c对检测的干扰，大幅提高了抗干扰能力。同时，双试剂法，有利于提高试剂的灵敏度和稳定性。传统的检测系统使用的苯酚和4-氨基安替比林，其将色原物质放在同一试剂中，可能会自发地逐渐显色，稳定性较差，且检测灵敏度有限；而本发明，由于将色原物质分开放在r1和r2中，在没有检测时，不容易形成有色物质，比较稳定，因此可以利用灵敏度更高的色原物质，如toos和4-氨基安替比林等有效提高检测灵敏度。附图说明图1本发明的脂蛋白胆固醇检测系统结构原理图。图2为本发明的脂蛋白胆固醇图谱。具体实施方式下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。如附图1所示：本发明的一种脂蛋白胆固醇检测系统，该系统包括第一试剂容器1、第二试剂容器2、样本容器3、冲洗容器4，第一反应模块5，第二反应模块6和检测模块7；所述的样本容器和第一试剂容器通过管道并联于第一反应模块的进口管道上，所述的冲洗容器通过管道连接于样本容器与第一反应模块连接的管道上；所述的第一反应模块的出口与第二反应模块的进口通过管道连接，所述的第二试剂容器通过管道连接于第一反应模块与第二反应模块相连接的管道上；所述的第二反应模块的出口端连接检测模块。所述的样本容器的出口管道上设置有第一控制阀8和传感器9，所述的传感器用于检测样本是否流完，所述的第一控制阀用于控制出口管道的开合，当所述的传感器检测到样本流完所述的第一控制阀关闭、当所述的传感器检测到样本存在则控制第一控制阀开启。所述的冲洗容器出口端连接的管道上设置有第二控制阀10，当所述的第一控制阀关闭时所述的第二控制阀打开以使得清洗液对管路进行清洗。所述的样本容器与冲洗容器的连接处设置有第一三通阀11，所述的样本容器、第一试剂容器和第一反应模块的连接处设置有第二三通阀12，所述的第二试剂容器、第一反应模块和第二反应模块的连接处设置有第三三通阀13。所述的第一试剂容器的出口管道上设置有第一泵体14，所述的第二试剂容器的出口管道上设置有第二泵体15。所述的第一反应模块为具有一定长度的管路，且具有温控功能；采用该结构，液体流经该模块时，可以孵育一定的时间，使反应进行，同时具有温控功能如通过水浴、金属浴、气浴等控制温度，温度的控制有利于反应在较适合的条件下进行，且可以使得每个样本反应在相同的条件下进行。所述的第二反应模块为具有一定长度的管路，且具有温控功能；采用该结构，液体流经该模块时，可以孵育一定的时间，使反应进行，同时具有温控功能如水浴、金属浴、气浴等控制温度，温度的控制有利于反应在较适合的条件下进行，且可以使得每个样本反应在相同的条件下进行。所述的检测模块的出口端的管路上连接有第三泵体16和废液收集罐17，且检测模块(通常检测模块可以是分光光度计)还电连接有记录模块18(市售能用量数据记录的纪录模块)和存储设备19(如可移动磁盘或电脑等存储设备)。采用上述结构，从检测模块出来的材料被废液收集罐及时的收集，不会对环境造成污染和破坏；而记录模块可以直接记录检测的结果，并进行打印，而存储设备可以将数据进行保存。本发明所述的控制器可以为可编程控制器，传感器设置在管道中并与所述可编程控制器电联；第一控制阀和第二控制阀分别设置在管道中相应位置并与所述可编程控制器电连接，传感器也与可编程控制器电连接；其中，所述传感器用于探测所述管道中的液体信息，并将所述液体信息通过电信号传递给所述可编程控制器；所述第一控制阀和第二控制阀分别控制相应管道的闭合或者开启；所述的传感器可以为流量传感器，探测液体管路中的液体信息，并将液体信息通过电信号传递给可编程控制器；所述的传感器和控制阀均由控制器进行控制，当有样本在进行检测时，第一控制阀是处于打开状态使样本进入管路，当一个样本进样完毕后，第一控制阀关闭，第二控制阀打开，位于生理盐水容器内的生理盐水进入管路，对管路进行清洗，以备下一个样本的检测做准备。上述的控制器、传感器和阀均为市售产品，只要能满足本发明的上述功能均可以用于本发明。本发明所述的第一试剂容器内盛放有试剂r1。本发明所述的试剂r1主要成分是表面活性剂lutensolap8和曲拉通x-100、4-aap、抗换血酸氧化酶等；本发明所述的第二试剂容器内盛放有试剂r2，试剂r2主要成分是胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶、toos等。本发明的主要作用原理和流程如图1所示：经过超速离心分离后的样本，在图1中的样本容器的底部进入仪器，同时收到传感器的检测，一旦样本流干，控制器就会控制第一控制阀就会闭合，使空气不会进入仪器的管路系统内。传感器和第一控制阀由控制器进行控制；当有样本在进行检测时，第一控制阀是处于打开状态，可以使样本进入管路，当一个样本进样完毕后，第一控制阀关闭，第二控制阀打开，位于清洗容器内清洗溶液如生理盐水进入管路，对管路进行清洗，以备下一个样本的检测做准备。当清洗完毕时，且下一个样本准备就绪后，第二控制阀关闭，第一控制阀打开，进行下一个样本的检测。本发明样本容器中的样本是经过离心处理后的样本，具体的操作过程和各个容器内的试剂或介质的成分、浓度以及运行参数见下述实施例。本发明的第一反应模块和第二反应模块为一定程度的管道，具体的管道长度在本实施例中可以第一反应模块的管道长度为1.5m，第二反应模块的管道长度为1.5m。实施例1样本检测结果比较取血清50ul，加入1950ul的kbr(密度调节至1.21)稀释，混匀。取一5.1ml的polyallomer快封管，加入3800ul的生理盐水，再从底部缓缓加入预先稀释好的血清样本1200ul。将该离心管放入转子vti-65.2转子中，并用beckman超速离心机离心。参数：转速＝65000rpm，ω2t＝6.6*1010rad2/sec，温度＝23℃，加速＝6，减速＝6。将离心后的样本小心地移至本发明系统上(即样本容器)，进行检测，检测参数为：样本流速1.0ml/min，试剂r1流速0.5ml/min，试剂r2流速0.5ml/min。其中，检测所用的试剂如下：作为对照，取同一份血清，以相同的方法前处理离心。并将样本小心地移至原vap仪器上(如us5284773，us5633168中公开的系统)，进行检测，参数为：样本流速1.0ml/min，试剂r流速1.0ml/min，检测所用的试剂如下：50mmpb，1mm4-aap，2mm苯酚，2ku/l胆固醇氧化酶，2ku/l胆固醇酯酶，2ku/l过氧化物酶，1.0％曲拉通x-100，0.1％lutensolap8，0.1％叠氮钠。所获得的脂蛋白胆固醇图谱如2所示，并用专用软件计算获得相应的组分的数据。见表1所示。由图谱和下列检测结果可见，检测的结果与原vap系统几乎没有差别。表1实施例2灵敏度的比较取一份ldl值约为100mg/dl的血清样本，平均分6份，按照实施例1的方法进行样本处理和离心步骤。其中三份用原vap系统检测，另外三份用本发明vap系统检测。观察各个峰值处吸光度的大小，并用三次检测的平均值计算。表2原vap本发明vap吸光度变化ldl峰值处吸光度0.2650.526198.49％hdl峰值处吸光度0.1010.201199.01％vldl峰值处吸光度0.0210.041195.24％由表2可知，本发明的vap系统，其检测灵敏度较原vap系统有了较大提升，因此用本发明的vap仪器，其具有更高的灵敏度，更加有利于某些含量比较低的脂蛋白亚组分的检测。实施例3抗干扰能力比较取一混合血清，分别加入不同浓度的干扰物质，并按实施例1中的方法进行检测。选择其中的ldl和hdl检测值进行计算比较，所得的实验结果见表3(ldl抗干扰实验数据)和表4(hdl抗干扰实验数据)。表3ldl抗干扰实验数据表4hdl抗干扰实验数据从上述两份表格可以看出，本发明的系统抗干扰能力更强。当前第1页12