放射生物学实验用放射性肺炎CT定量检测方法与流程

本发明技术属于实验方法，涉及ct定量检测方法，尤其涉及一种放射生物学(鼠类)实验用放射性肺炎ct定量检测方法。

背景技术

小鼠放射性肺炎模型是研究正常组织辐射反应、呼吸系统疾病与免疫应答反应机制的重要工具，在放射生物学、放射治疗学与抗肺损伤药物研发中具有不可替代的作用。放射性肺损伤早期主要表现为放射性肺炎(通常继发放疗后1-3月)，由于大量t淋巴细胞受到激活产生免疫应答反应，一种淋巴细胞性肺泡炎；晚期可发展为间质性肺纤维化(照射后6个月左右)。一旦肺纤维化发生其后果是严重通气障碍或呼吸功能衰竭，随之引起慢性肺源性心脏病，最终导致心肺功能障碍恶性循环(心肺综合征)。

然而，国内外目前正对小鼠放射性肺炎的发生、发展尚无客观、无创、准确的定量检测技术，这极大地制约了这一重要研究领域的发展。在过去几十年中，国际上仍然采用多种侵入性和/或非侵入性技术来量化照射后实验小鼠肺毒性反应，包括致死率，呼吸频率或肺顺应性，组织学改变，以及运用高分辨ct和micro-ct来检测和评估放射毒性效应。然而，这些检测评估手段尚存在诸多技术缺陷。

第一，生理学参数(即呼吸频率，肺顺应性，致死率或体重)可以较客观反应肺部限制性通气障碍、弥漫性间质炎症或瘢痕引起的异常气体交换，但这些参数容易受诸多其他因素的干扰，如温度、感染、合并心脏毒性等。

第二，使用低剂量照射时只能在肺组织切片能观察到少量肺炎，这些生理学指标在病变程度较轻或自愈阶段并不能真实反应肺部病变：亦观察不到明显的呼吸频率改变、个体死亡或体重下降(如x线剂量<10.5gy时)，容易出现假阴性情况。然而这种假阴性情况，在数学建模中通常需要梯度剂量(从低到高)测量值进行运算和模拟，即低剂量组检测值灵敏度将直接影响模型的准确性和可靠性。

第三，由于肺功能具有较大代偿能力，对于早期肺损伤(即炎症阶段)的评估，组织学肺间质增厚证据、炎性细胞增生或浸润与小鼠个体死亡或呼吸频率升高并无直接相关性，这在一定程度上影响到结果的准确性。

第四，从统计学的角度，这些方法测定采集数据都属于序数变量(ordinaldata)或量反应数据(gradedresponsedata)，在进行probit或logistic模型分析之前，必须根据实验动物总数量进行量化反应(quantalresponse)转换。这通常要求每次试验不同实验组均需要保持相当大的初始样本量，尤其需要考虑到中晚期的放射性毒副作用(如严重放射性皮炎)及高剂量组显著增加的个体死亡。

第五，虽然无创高分辨ct或micro-ct在鉴别晚期肺纤维上具有一定优势，但这一优势依赖于过度胶原蛋白产生以及瘢痕形成。而放射性肺炎并不具备这一纤维化改变，因此仅凭高分辨ct或micro-ct图像本身难以实现对小鼠早期肺部炎症的检测。此外，放射性肺损伤与辐射剂量密切相关，长期ct随访造成的额外x线剂量负担导致的风险不容忽视。一般ct图像噪声(noisepropagation)与(剂量dose)^-1/2和(像素尺寸isotropicvoxelsize)^-2成正比。这意味在ct图像中，固有分辨率每提高n倍，小鼠接受的辐射剂量需要提高n⁴倍。简单地说，在micro-ct或高分辨率ct中为减少图像运动伪影(如呼吸、心跳)，需要运用相对较长的扫描时间和呼吸门控技术，每次扫描暴露的x线剂量可达100-300mgy，这将直接干扰放射性剂量试验。

临床上ct或x线透视胸片是诊断肺炎的常用方法。但由于小鼠个体微小(成年小鼠肺部横径仅约1-1.5cm)受ct扫描分辨率制约，即便是高分辨或专业micro-ct图像都无法准确诊断小鼠放射性肺炎。鉴于目前放射性肺损伤小鼠实验存在上述的缺陷，无法达到客观准确定量评估的目的，本发明检测方法采用计算机辅助影像诊断(computer-assistedradiology)技术，来实现一种简便、准确且能定量评估肺炎发展程度的方法。计算机辅助影像诊断技术是指通过影像学、医学图像处理技术以及其他可能的生理、生化手段，结合计算机的分析计算，辅助发现病灶，提高诊断的准确率技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种放射生物学(鼠类)实验用放射性肺炎ct定量检测方法，通过以下步骤实现：

(1)ct的低剂量扫描参数包括：80kv，80mas，间距为0.6mm，层厚0.6mm，采集时间为32s；该参数可以应用于西门子、东芝、飞利浦、ge等不同厂家的临床ct设备，均可兼容。

(2)扫描图像经三维重建后基于自动区域生长肺部图像矩阵三维分割技术，包含了(a)图像三维重建和(b)自动区域生长分割两部分；

其中(a)图像三维重建：使用滤波器核h50s、h60s将图像重建为138×138mm²的横向fov作为512×512矩阵；

(b)自动区域生长分割：使用图像后处理软件(如osirix等)手动剪切ct图像中的气管后，肺组织窗定义在(-1000，0)之间，输入以上两个极值(最大与最小)进行自动区域生长分割，从而获得ct肺部三维矩阵，提取在10hu的区间中合并的相同肺部区域的直方图，在sumo软件中使用0.2的采样比例的负指数进一步平滑直方图；

(3)肺炎程度定量标准采用肺炎指数(pneumonitisindex,pi)算法，经上述ct扫描成像、三维图像重建与自动区域生长分割，即可获得ct三维分割图像像素直方图，符合泊松分布，将分割后的肺组织窗(-900,0)分为含气区(-900,-450)和肺间质区(-450,0)两部分，根据像素直方图取hu绝对值：

huⁱ＝hu+1000(1)

计算灰度值像素分布加权(huweighted):

histo′i＝histoi×ho′i(2)

计算灰度值加权平均值(averagedweightedhu):

因此，小鼠肺间质指数(p)为区间总和：

根据照射组与空白对照组肺间质指数比值，可得出肺炎指数为：

由此，可以计算一个被定义为肺炎指数(pi)的数值，该数值越大即客观反应小鼠放射性肺炎程度越高；该数值越小，即肺炎程度越低，定义正常健康小鼠肺炎指数为1(pi＝1)。

受图像分辨率制约，ct图像对小鼠放射性肺炎无明确诊断价值。本发明检测方法利用三维图像像素直方图，借助数学算法以实现计算机辅助影像诊断，根本性地提升了该方法敏感性、从而适用于放射性小鼠肺炎模型的深入研究。像素直方图对肺组织密度，包括肺部含气区和肺间质区具有准确的反映。本发明正是着眼于像素直方图肺间质区的改变找到“突破口”。采用类似于分子生物学聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)的思路，即仿照dna聚合酶来扩增特定的dna片段的方式，尝试通过数学运算将隐藏于直方图肺间质区的“密码(code)”放大到相对明显的范围。并最终利用灰度值加权的方式，实现这一目的，建立了可无创定量评估小鼠放射性肺炎的方法，具有无创、快速扫描、精度高、重复性好等显著优势。具有较强的科研应用及实际推广价值。

本方法有效填补了国内外针对小鼠放射性肺炎模型无创定量检测方法的空白，提供一种能首次实现客观、实时、精准定量小鼠肺炎发生、发展的检测方法。该技术可显著增加辐射诱导小鼠放射性肺炎检测的准确性、简易性、稳定性和高效性。大幅减低实验成本与精力的同时、也减少了对小动物微型ct(价格昂贵且不能定量)的依赖性，依靠临床ct就能独立开展高精度、大批量小鼠放射性肺炎检测与跟踪定量。

附图说明

图1临床ct扫描小鼠肺部及重建后图像三维分割示意图。

图2本发明ct无创定量检测技术与传统方法对比示意图。

图3像素直方图热图动态追踪分析小鼠放射性肺炎。

图4小鼠放射性肺炎组织病理学验证(12周)。

图5不同胸部辐射剂量下，小鼠放射性肺炎的发生发展程度(he染色)。

图6本发明方法用于小鼠放射性肺炎实验模型的定量与建模。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。

实施例1放射生物学(鼠类)实验用放射性肺炎ct定量检测方法

使用常规医用直线加速器进行小鼠全肺野照射，完成小鼠放射性肺炎模型造模。小鼠处于麻醉状态，固定良好。

参照图1，小鼠全肺野照射后不同时间点，使用医用常规计算机断层扫描(ct)设备采用低剂量扫描参数进行图像采集；随后行三维图像重建、基于自动区域生长的肺部三维分割。

参照图2，本发明ct无创定量检测技术与传统方法的直观比较。以往传统ct图像评价通常采用感兴趣区选择法(regionsofinterests,rois)，其主要缺点包括：主观性大(依靠实验者的主观勾勒范围)、对肺炎无诊断价值、扫描过程中x线暴露剂量较大、性价比较低。而本发明首创的(i)基于临床ct的低剂量扫描参数、(ii)扫描图像经三维重建后基于自动区域生长肺部图像矩阵三维分割两者结合可以直接获得基于全肺野的定量ct改变，转化成像素直方图进行深入分析。

参照图3，取照射后肺组织进行组织病理学验证小鼠肺部炎症。为使肺泡处于扩张状态、更好地观察肺组织的炎症细胞浸润状态，通常采用4％福尔马林灌注肺腔后进行石蜡包埋染色切片分析。

参照图4，ct像素直方图与热图动态追踪分析小鼠放射性肺炎发展情况，并获得组织病理学验证。辐射诱导小鼠肺炎模型20gyx线照射后早期ct随访扫描图像(左上)、对应像素直方图(左中)及平均像素直方图热图分析(左下，n＝6)与炎症期组织学改变(右)。由此可见，在全肺照射后第4、8、12周小鼠随访micro-ct图像中均无明显差异，放射性肺炎的影像学表现呈现阴性。而利用像素直方图热图追踪分析，显示照射后第12周出现的热区“右移”现象(箭头)，提示肺炎病变。

参照图5，不同胸部辐射剂量下，小鼠放射性肺炎的发生发展程度(he染色)。该组织病理学切片分析显示小鼠放射性肺炎的发生、发展程度与辐射剂量大小存在直接的关联。

参照图6，采用本发明定量检测方法用于小鼠放射性肺炎实验模型的定量与建模，可以区分不同辐射剂量引起的放射性肺炎。图中为采用两个阳性对照小鼠实验模型，给予野生型c57bl6小鼠dna依赖性蛋白激酶抑制剂ms-3814(ms，促放射性肺炎)或dna依赖性蛋白激酶敲除c57bl6小鼠(dna-pkcsk.o.)在x线梯度剂量全肺照射后，方框形：梯度剂量x线照射小鼠同时给予dna依赖性蛋白激酶(dna-pkcs)抑制剂ms-3814后肺炎发生、发展程度；三角形：dna依赖性蛋白激酶敲除小鼠给予梯度剂量x线照射后后肺炎发生、发展程度，再基于ct三维分割像素直方图“肺炎指数”计算的效应-剂量曲线。

实施例2：采用8-10周龄c57bl6接受全肺野照射后12周，进行肺炎的定量检测，具体方法介绍如下：

1.动物实验照射及分组：采用8-10周龄c57bl6雌性小鼠，spf级饲养，饲养条件为，温度(23±1)℃，相对湿度55％±5％，压力差≤10pa，每日光照12h，自由摄食饮水。

2.照射前经异氟烷诱导麻醉后，转移至专用小鼠胸部照射装置并妥善固定。采用常规医用直线加速器进行全肺野照射。

3.给予单次20gy照射剂量。

4.空白对照组不接受x线照射(0gy)。对照组与各剂量实验组每组均随机分配12只小鼠；

5.照射前及照射后每隔4周行ct扫描成像(分别为0、4、8、12周时间点)；低剂量扫描技术参数：80kv，80mas，间距为0.6mm，层厚0.6mm，采集时间为32s；

6.将扫描后图像重建为138×138mm²的横向fov作为512×512矩阵；

7.ct图像三维重建后经自动区域生长三维分割，提取在10hu的区间中合并的相同肺部区域的直方图，使用0.2的采样比例的负指数进一步平滑直方图；

8.基于ct三维分割肺部图像矩阵进行肺炎指数计算，确定肺炎发生、发展程度；

9.新鲜肺组织提取：于照射后第24周采用颈椎脱臼法处死小鼠，提取新鲜肺组织用于进一步组织学与分子生物学研究，包括福尔马林固定石蜡包埋组织，mrna与蛋白质冻存；

10.组织病理学验证：石蜡包埋切片用苏木精和伊红(he)染色、胶原蛋白染色以检查形态和纤维蛋白沉积。炎症细胞的浸润与肺泡间隔厚度将采用半定量评分；

11.统计学处理：采用graphpadprism7软件进行数据分析。所有数据均符合正态分布，数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。p<0.05为差异有统计学意义。