一种多目标物碟式侧流试纸芯片及其激光切割制备方法、使用方法、应用和检测装置与流程

本发明属于环境、食品安全及生物医学相关检测技术领域，具体涉及一种多目标物碟式侧流试纸芯片及其激光切割制备方法、使用方法、应用和检测装置。

背景技术：

快速、灵敏、便携的多目标物检测方式在环境监测、食品安全和生物医学检测领域中得到越来越多的关注。例如，病原体、重金属离子、细菌等有毒物质都是水质评价的重要指标；此外，作为全球公共卫生最关注的问题之一，食源性疾病常由不同种类的污染物(如细菌、抗生素、非法添加剂和农药残留)污染食物引起的，这造成每年有十分之一的人口因此而生病；另外，在疾病检测中，医生通常需要在血液样本中对细菌、真菌等目标物的含量进行评估，以精确诊断其症状是否由炎症、真菌感染或毒素积累引起。因此，以快速、低成本、可靠的方式同时检测同一样品中的多目标是非常必要的。

现有实验室分析方法如液相或气相色谱、质谱和聚合酶链反应常被用作分析样品的金标准，能够在高灵敏度和选择性下进行检测，然而，这些方法既费时又费钱，且需要训练有素的操作员。

侧流试纸是一种快速检测的常规方法，具有特异性、灵敏、快速且便携的优点，广泛应用于食品中毒素、病原微生物以及抗生素残留的筛查。这种方法目前在不少研究中通过多检测线的方式实现了多种目标物的同时检测，但是，目前检测时使用的都是单根侧流试纸，单根侧流试纸空间有限，无法针对更多目标物进行检测，且无法避免多目标物之间的交叉反应。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种多目标物碟式侧流试纸芯片及其激光切割制备方法、使用方法、应用和检测装置，使用该方法制备多目标物碟式侧流试纸芯片，操作简单，制作快捷，成本低廉，能耗低，制备周期短。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的一种多目标物碟式侧流试纸芯片，包括圆形的疏水基板，在疏水基板中部设有探针储存垫，沿疏水基板圆周设有若干条与探针储存垫连通的亲水通道，在疏水基板圆周上还设有能够覆盖部分亲水通道的吸水区。

优选地，所述探针储存垫覆盖部分亲水通道。

进一步优选地，被覆盖的部分亲水通道的长度为1～3mm。

优选地，疏水基板采用pvc背胶板制成，亲水通道采用硝酸纤维素膜制成，探针储存垫采用样品垫制成，吸水区采用吸水垫制成；

疏水基板、亲水通道、探针储存垫及吸水区均采用激光切割法制成。

本发明还公开了上述的多目标物碟式侧流试纸芯片的制备方法，包括以下步骤：

1)根据待检测的目标测试需求，设计疏水基板、亲水通道、探针储存垫及吸水区对应的尺寸和形状；

2)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割pvc背胶板，制得能够自由粘贴的圆形的疏水基板；

3)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割硝酸纤维素膜，获得亲水通道；

4)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割样品垫，获得探针储存垫；

5)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割吸水垫，获得吸水区；

6)将疏水基板上切割出的对应通道位置的不粘胶撕下，然后将步骤3)切割出的亲水通道贴合在该通道位置；然后再依次贴上探针储存垫和吸水区；

7)再采用激光切割设备沿着圆形的疏水基板外轮廓切割，制得多目标物碟式侧流试纸芯片。

优选地，采用激光设备进行激光切割的参数如下：

本发明还公开了上述的多目标物碟式侧流试纸芯片在多目标物环境、食品安全及生物医学等相关领域检测中的应用。

本发明还公开了上述的多目标物碟式侧流试纸芯片的使用方法，包括以下步骤：

1)制备经水溶性修饰的稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒；

2)制备与待检测目标物对应的若干个上转换-适配体荧光探针，并分别溶解于缓冲液中，然后分别烘干于多目标物碟式侧流试纸芯片的探针储存垫的一侧分支上，再采用生物素-链霉素反应，将生物素修饰的能够与目标物适配体互补配对的cdna单链以点状分别固定于探针储存垫上相对一侧的分支上；

3)制备已知浓度的检测体系，将样品滴加于步骤2)处理后的探针储存垫的正中央，反应30min，采集激发光下检测线的照片，分析灰度值并绘制标准曲线；

4)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值：制备样品检测体系：取目标物加入自来水中，按上述步骤加入探针进行检测，根据测得的待测样品灰度值，查目标浓度对数值与对应的荧光值标准曲线，即求得样品中目标物的数量。

本发明还公开了与上述的多目标物碟式侧流试纸芯片配合使用的检测装置，包括壳体，在壳体内集成有芯片槽、激光器、ccd相机和光纤准直激光头，ccd相机和光纤准直激光头配合形成的激光光路上设有分光镜片；芯片槽与所述多目标物碟式侧流试纸芯片形状和尺寸相适应；

还包括与芯片槽相连的步进电机，步进电机能够驱动芯片槽旋转，使多目标物碟式侧流试纸芯片旋转至激光光路测试范围中。

优选地，芯片槽底部固定于抽拉层上，在与抽拉层位置对应的壳体外壁上开设有用于供抽拉层进出的插拔口。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的多目标物碟式侧流试纸芯片，第一，由于在圆形的疏水基板上设置了若干条与探针储存垫连通的亲水通道，能够实现多目标物同时检测的目的，更便于集成与实验结果优化；第二，可以根据不同检测需求设计通道数量、通道长度及检测类型等，可开发性能强大；第三，以毛细作用引导液体流动，无需额外的流体驱动装置，生物兼容性好，后处理简单。

本发明公开的多目标物碟式侧流试纸芯片的制备方法，根据待检测的目标测试需求设计好试纸芯片各个区域的尺寸和形状，采用激光切割工艺制备试纸芯片，简单快捷，制作周期短(十分钟即可)，能耗小，精度高，重复性好，操作简单。

进一步地，本发明针对不同的材料(厚度、密度等参数不同)，使用不同强度的激光切割参数，经过实验探究影响最大的两个参数条件为速度和功率，因此，本方法进一步对激光切割的速度和功率做了明确的限定。

本发明的多目标蝶式侧流试纸芯片能够结合比色分析、荧光分析等成熟技术手段，实现多目标物的快速定量检测，因此能够作为小型化、快速化的现场快速检测器具，特别是在临床诊断、食品卫生、环境监测及生物化学等领域有很好的应用前景。

本发明公开的能够与上述多目标蝶式侧流试纸芯片配合使用的检测装置，结构设计合理，将检测元件集成在一个壳体内，体积小携带方便，检测时根据需要通过步进电机驱动芯片槽旋转，从而使多目标碟式侧流试纸芯片需要测试的一侧转动到测试激光光路范围内，十分便捷的完成测试过程。

附图说明

图1为多目标物碟式侧流试纸芯片的结构示意图；

图2为实施例中设计的亲水通道结构示意图；

图3为实施例中设计的吸水垫结构示意图；

图4为实施例中设计的探针储存垫结构示意图；

图5为实施例中的多目标物碟式侧流试纸芯片的照片；

图6为与本发明的多目标物碟式侧流试纸芯片配合使用的检测装置结构示意图；

图7为本发明检测装置的芯片槽结构示意图。

其中，1为疏水基板；2为亲水通道；3为探针储存垫；4为吸水区；5为ccd相机；6为步进电机；7为分光镜片；8为激光器；9为壳体；10为抽拉层；11为芯片槽；12为光纤准直激光头。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

参见图1，一种多目标物碟式侧流试纸芯片，包括圆形的疏水基板1，在疏水基板1中部设有探针储存垫3，沿疏水基板1圆周设有若干条与探针储存垫3连通的亲水通道2，在疏水基板1圆周上还设有能够覆盖部分亲水通道2的吸水区4。

上述多目标物碟式侧流试纸芯片采用激光切割工艺制成，包括疏水基板1、亲水通道2、探针储存垫3以及吸水区4的制备，将上述制备的各个区域部件逐次贴合，得到的纸基微流控芯片即为多目标物碟式侧流试纸芯片。

具体方法，包括以下步骤：

1)根据待检测的目标测试需求，设计疏水基板1、亲水通道2、探针储存垫3及吸水区4对应的尺寸和形状；

2)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割pvc背胶板，制得能够自由粘贴的圆形的疏水基板1；

3)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割硝酸纤维素膜，获得亲水通道2；

4)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割样品垫，获得探针储存垫3；

5)根据步骤1)设计的尺寸和形状，采用激光切割设备切割吸水垫，获得吸水区4；

6)将疏水基板1上切割出的对应通道位置的不粘胶撕下，然后将步骤3切割出的亲水通道2贴合在该通道位置；然后再依次贴上探针储存垫3和吸水区4；

7)再采用激光切割设备沿着圆形的疏水基板1外轮廓切割，制得多目标物碟式侧流试纸芯片。

具体地，本发明提供的一个实施例公开的多目标物碟式侧流试纸芯片，设有三组即6个亲水通道，且成对称布置，如图1和图5所示，包括圆形的疏水基板1，在疏水基板1中部设有探针储存垫3，沿疏水基板1圆周等角度设有6条与探针储存垫3连通的亲水通道2，在疏水基板1圆周上还设有能够覆盖部分亲水通道1的吸水区4。所有吸水区4与亲水通道2及探针储存垫3重合约2mm。

上述多目标物碟式侧流试纸芯片的制备方法：

1)将pvc背胶板(6cm×6cm)置于激光切割机上，以参数功率30％、速度100％按照上述结构预先设计的基板图纸切割，获得可自由粘贴的疏水基板1。

2)将硝酸纤维素膜置于激光切割机，以参数功率10％、速度100％按照预先设计的亲水通道图纸切割，获得亲水通道2，如图2；

3)将样品垫置于激光切割机，以参数功率30％、速度100％按照预先设计的样品垫图纸切割，获得探针储存垫3，如图4；

4)将吸水垫置于激光切割机，以参数功率100％、速度100％按照预先设计的吸水垫图纸切割，获得吸水区4，如图3；

5)将疏水基板1上经过切割的通道上的胶面撕下，将切割后的亲水通道2贴合在其上；再依次贴上探针储存垫3与吸水区4，保证所有吸水区4与探针储存垫3及亲水通道2约重合2mm，如图5；

6)在激光切割机上以参数功率100％，速度60％沿芯片外轮廓切割，即获得多目标碟式侧流试纸芯片。

参见图6，本发明还公开了一种能够与上述多目标物碟式侧流试纸芯片配合使用的检测装置，包括壳体9，在壳体9内集成有芯片槽11、激光器8、ccd相机5和光纤准直激光头12，ccd相机5和光纤准直激光头12配合形成的激光光路上设有分光镜片7；芯片槽11与所述多目标物碟式侧流试纸芯片形状和尺寸相适应，芯片槽11可以根据碟式芯片的测试通道数量进行调整；

还包括与芯片槽11相连的步进电机6，步进电机6能够驱动芯片槽11旋转，使多目标物碟式侧流试纸芯片旋转至激光光路测试范围中。

优选地，芯片槽11底部固定于抽拉层10上，在与抽拉层10位置对应的壳体9的外壁上开设有用于供抽拉层10进出的插拔口。

参见图7，需要说明的是，本装置的芯片槽上的孔洞数量可以根据试纸芯片上的流道数量进行对应设置，使用时只需设置不同的转动角度即可。

上述装置在工作时，用户通过信号输入装置发送指令，控制单片机让步进电机带动芯片槽转动，从而使多目标物碟式侧流试纸芯片中加入待测试样品的一侧旋转至激光光路测试范围中。

此处所述的信号输入装置以现有技术能够实现的技术为参照，如设置输入面板，或者通过蓝牙、wifi等模块连接手机等移动终端。

下面以采用本发明的多目标物碟式侧流试纸芯片同时检测hg²⁺、赭曲霉毒素a和沙门氏菌的实际应用说明本发明的多目标物检测效果。

具体实验过程，包括以下步骤：

1)将pvc背胶板(6cm×6cm)置于激光切割机上，以参数功率30％、速度100％按照预先设计的基板图纸切割，获得外径5.4cm的可自由粘贴的疏水基板。

2)按照切割图案撕下疏水基板上的不干胶，将两片硝酸纤维素膜(2.5cm×6cm)并排贴在其上，然后置于激光切割机中，以参数功率10％、速度100％按照预先设计的亲水通道图纸切割，去除切割下来的多余部分，获得亲水通道。

3)将样品垫(2cm×30cm)置于激光切割机，以参数功率30％、速度100％按照预先设计的样品垫图纸切割，获得探针储存垫。

4)将吸水垫(30cm×30cm)置于激光切割机，以参数功率100％、速度100％按照预先设计的吸水垫图纸切割，获得吸水区。

5)依次贴上探针储存垫与吸水区，保证所有吸水区与探针储存垫与亲水通道约重合2mm。最终，在激光切割机上以参数功率100％，速度60％沿芯片外轮廓切割，即多目标获得碟式侧流试纸芯片。

6)分别将naoh、nh4f、ycl3以及稀土激活剂的氯化物、稀土敏化剂的氯化物加入有机溶剂中，加热至280～290℃，保温反应0.5～3小时，制得稀土掺杂上转换荧光纳米颗粒；采用表面配体交换法，使用聚丙烯酸对稀土掺杂上转换荧光纳米粒进行水溶性修饰；(具体制备过程，可以参考中国专利：zl201310439588.6)。

7)采用缩合反应，选取hg²⁺、赭曲霉毒素a和沙门氏菌的寡核苷酸适配体，分别制备hg²⁺、赭曲霉毒素a和沙门氏菌上转换-适配体荧光探针，分别按比例溶解在标准缓冲液中(tris-hcl(10mm,ph＝7.4)，ssc(8×),tween20(2％v/v),bsa(16％w/v))，并取20μl分别烘干在步骤5)所得碟式侧流试纸的样品垫的每个分支上。(具体制备过程，可以参考中国专利：zl201711449937.7)

选用由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的特异性适配体：

hg²⁺的适配体的序列如seq.id.no.1所示，具体为：

5’-gctgagtctgagtcgtcatgtttgtttgttggccccccttctttctta-3’；

赭曲霉毒素a的适配体序列如seq.id.no.2所示，具体为：

5’-gctgagtctgagtcgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’；

沙门氏菌的适配体序列如seq.id.no.3所示，具体为：

5’-gctgagtctgagtcgtatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag-3’

8)采用生物素-链霉素反应，将生物素修饰的与三种适配体互补配对的cdna单链以点状分别固定于对应的亲水通道的检测区域。

选用由生工生物工程(上海)股份有限公司合成cdna，序列分别为：

hg²⁺：5’-ccaacaaacaaa-3’(如seq.id.no.4所示)

赭曲霉毒素a：5’-cccacacccgat-3’(如seq.id.no.5所示)

沙门氏菌：5’-ctgtcataatgtcaag-3’(如seq.id.no.6所示)；

9)制备已知浓度的检测体系，将样品滴加在步骤8)制备好的多目标碟式侧流试纸芯片的探针储存垫正中央，经过30分钟反应，用ccd相机采集980nm激发下检测线的照片，分析其灰度值并绘制标准曲线；

10)制备待测样品检测体系，测定待测样品的灰度值；制备样品检测体系：取目标物加入自来水中，按上述步骤加入探针进行检测，根据测得的待测样品灰度值，查目标浓度对数值与对应的荧光值标准曲线，即求得样品中目标物的数量。

结果，使用本发明的碟式芯片可在40分钟内完成多目标物的检测，目标物的数量可根据实际情况扩展。相比常规试纸一一筛查来说，大大降低了检测时间。

综上所述，通过上述实施例，可以看出，本发明方法制作简单，价格低廉，操作便捷，可通过适配子序列的更换测定各种试样并能实现三种目标物的同时检测，在环境监测及食品安全分析等方面具有十分重要的意义。

序列表

<110>西安交通大学

<120>一种多目标物碟式侧流试纸芯片及其激光切割制备方法、使用方法、应用和检测装置

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gctgagtctgagtcgtcatgtttgtttgttggccccccttctttctta48

<210>2

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gctgagtctgagtcgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca50

<210>3

<211>55

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gctgagtctgagtcgtatggcggcgtcacccgacggggacttgacattatgacag55

<210>4

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

ccaacaaacaaa12

<210>5

<211>12

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cccacacccgat12

<210>6

<211>16

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctgtcataatgtcaag16