本发明涉及食品检测领域。更具体地，涉及一种检测动物组织动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物含量的方法及其样品前处理方法。
背景技术
喹噁啉类药物是一类化学合成类的抗菌促生长剂，主要包括喹乙醇、卡巴氧、喹烯酮、乙酰甲喹等药物。20世纪80年代以来，喹噁啉类药物作为一种比较理想的饲料添加剂，在家畜和家禽等的饲料中被广泛应用。动物使用喹噁啉类药物后，可提高饲料的转化效率，令蛋白质的同化速率加快，使动物体内氮的贮存含量更高，使细胞形成加速、体内组织增大，加快长肉速率。但过量使用此类药物也会产生一些毒害作用，如dna致突变和损伤，破坏细胞抗氧化作用系统，引起细胞自由基的产生，引起细胞周期阻滞和细胞凋亡。动物实验发现喹噁啉类药物对肾上腺肝脏、脾脏和睾丸均有损伤作用。人类食用含有喹噁啉类药物残留的动物肌肉组织后，也会产生一定的危害。由于喹乙醇的毒副作用较强，中国在1997年禁止了喹乙醇在禽类养殖中的应用。2000年版兽药典中规定喹乙醇只能用于幼猪，禁用于禽和体重超过35千克的猪，休药期35天；2005年版兽药典中规定喹乙醇禁用于鱼类。然而，由于喹噁啉类药物的药效显著、价格低廉且能够产生较好的经济效益，因此在中国畜牧生产过程中仍存在大量使用此类药物的情况。
喹噁啉类药物经脱单氧、脱双氧后主要生成喹噁啉-2-羧酸(quinoxaline-2-carboxylicacid,qca)或3-甲基喹噁啉-2-羧酸(3-methyl-quinoxaline-2-carboxylicacid,mqca)。研究表明，mqca是喹乙醇在动物体内代谢后的主要产物，qca是卡巴氧在动物体内代谢后的主要产物，且该产物在动物体内滞留时间较长。因其含量与总残留关系稳定，所以mqca和qca能反应残留总量。国际联合国粮农组织(fao)/世界卫生组织(who)食品添加剂联合专家委员会(jecfa)于1995年将mqca和qca确定为喹噁啉类兽药的残留标示物和监控对象。2003年，中国农业部也规定肌肉和肝脏组织中mqca的最大残留限量分别为4μg/kg和50μg/kg。
中国国家标准gb/t20746-2006《牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、喹乙醇及代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》规定的方法包括以下步骤：(1)样品酶解：称取5.00g样品，加入10ml0.6％甲酸溶液，47℃振荡水浴1h，加入3mltris碱溶液，再加入0.3ml0.01g/ml蛋白酶水溶液，在47℃振荡水浴中酶解16-18小时。加入20ml0.3mol/l盐酸，振荡5min，在5000rpm离心15min,取上清液过滤。(2)样品净化：取滤液过oasismax固相萃取柱，3次3ml甲醇、3ml水、3次3ml0.1mol/l盐酸溶液和两次3ml甲酸水溶液(1:4)分别淋洗萃取柱，真空抽干后再用2ml乙酸乙酯淋洗，弃去淋洗液，用3ml2％甲酸-乙酸乙酯溶液洗脱3-甲基-喹噁啉-2-羧酸，45℃氮吹浓缩至干，1ml0.1％甲酸-甲醇溶液定容，过0.2μm微孔滤膜，供进样测定。(3)液相色谱-质谱测定。gb/t20746-2006所规定的前处理方法经过酶解、酸化、spe净化等多个步骤，前处理耗时长，处理一个样品需要两天的时间。
针对在检测喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物时的样品前处理步骤复杂的问题，亟需开发出一种新的适用于检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物含量的样品前处理方法，尤其是适用于液-质联用检测的高效灵敏的样品前处理的方法。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物含量的样品前处理方法，该方法耗时短、步骤简单，适用于同时、快速检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物的含量。
本发明的另一个目的在于提供一种能够准确检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物含量的方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明提供了一种检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物含量的样品前处理方法，包括以下步骤：
1)取待测动物肌肉组织样品，加入盐酸溶液进行酸解后，加入乙酸乙酯对喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物进行提取，得到混合液；
2)向提取后的混合液中加入mgso4和nacl，涡旋，离心，收集上层得上清液；
3)上清液经浓缩、复溶后，加入甲醇饱和正己烷溶液，涡旋，离心，收集下层溶液，过滤，即得待测溶液。
在本发明中，所述动物包括但不限于猪、牛、鸡、鱼、虾。
进一步，步骤1)所述酸解的条件为在20～60℃条件下酸解30min；优选的，在20℃条件下酸解30min。
进一步，步骤1)中所述盐酸溶液的浓度为0.5mol/l～2mol/l；所述待测动物肌肉组织样品与盐酸溶液的质量体积比为5g:4ml～5g:10ml。
进一步，步骤1)中所述待测动物肌肉组织样品与所述乙酸乙酯的质量体积比为5g:10ml～5g:20ml。
进一步，步骤2)中，所述mgso4的添加量与所述待测动物肌肉组织样品的质量比为2:5～6:5，所述nacl的添加量与所述待测动物肌肉组织样品的质量比为0.2:5～1:5。
进一步，步骤3)所述浓缩采用以氮气吹干的方式进行；所述复溶是采用甲醇-水-甲酸进行，其中，三者的体积比为1:9:0.001；所述过滤是采用孔径为0.2μm滤膜进行。
本发明进一步提供了一种检测动物肌肉组织中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物含量的方法，包括以下步骤：
(a)在待测动物肌肉组织样品中添加喹乙醇代谢物内标溶液和卡巴氧代谢物内标溶液，得到待处理样品；
(b)按照上述的样品前处理方法对待处理样品进行前处理，得到待测溶液；
(c)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对待测溶液中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物进行内标法定量检测。
在本发明中，所述喹乙醇代谢物为3-甲基喹噁啉-2-羧酸(mqca)；所述卡巴氧代谢物为喹噁啉-2-羧酸(qca)；相应的，所述喹乙醇代谢物内标为3-甲基喹噁啉-2-羧酸-d4(mqca-d4)，所述卡巴氧代谢物内标为喹噁啉-2-羧酸-d4(qca-d4)。
进一步，所述超高效液相色谱的检测条件为：
色谱柱：acquityuplcbehc18柱：1.7μm,2.1x100mm；
流动相：a为0.1％甲酸，b为甲醇；
流速：0.2ml/min；
柱温：40℃；
进样量：10μl；
洗脱方式：梯度洗脱；
其中，所述梯度洗脱程序为
进一步，所述三重四级杆质谱的检测条件为：
离子源：电喷雾离子源(esi源)；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测(mrm)；
分辨率：单位分辨率；
电喷雾电压：5500.0v；
雾化气流气：50.0l/min；
气帘气流速：30.0l/min；
辅助气流速：50.0l/min；
离子源温度：500℃。
进一步，所述内标法定量检测的方法包括：
配制喹乙醇代谢物标准工作液及其内标标准工作液和卡巴氧代谢物标准工作液及其内标标准工作液；通过超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪测定得到喹乙醇代谢物标准工作液及其内标标准工作液和卡巴氧代谢物标准工作液及其标准工作液各自的色谱峰；分别以喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物标准工作液的色谱峰面积与其内标标准工作液的色谱峰面积比为纵坐标，以喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物标准工作液的质量浓度与其内标标准工作液的质量浓度比为横坐标，作线性回归，得到喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的标准曲线；根据测得的喹乙醇代谢物及其内标和卡巴氧代谢物及其内标的色谱峰面积得到喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的含量。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的样品前处理方法待测样品不需要采用酶解，直接采用盐酸酸解，使mqca和qca从动物肌肉组织中解离出来，再采用乙酸乙酯进行提取，利用无水硫酸镁和氯化钠的盐析作用、放热作用和基质分散作用，加速mqca和qca的溶出和液液萃取过程，同时使大部分极性化合物杂质进入水相，与目标化合物分离，取乙酸乙酯相，浓缩、复溶后，再用正己烷去除部分脂溶性杂质，步骤简单，重复性好，需要仅2小时左右，相比于gb/t20746-2006规定的前处理方法需要2天，大大缩短了样品前处理时间。
2、本发明目标化合物在样品前处理中的损失是不可避免的，其损失程度决定了目标化合物的回收率好坏和分析结果的准确程度。本发明通过在样品前处理过程中加入内标化合物mqca-d4和qca-d4，随样品走完前处理和仪器分析的全过程，由于内标化合物不存在于样品中，且化学物理性质相似，在样品前处理过程中两者的损失程度是一致的，使得目标化合物在样品前处理过程中的回收率由内标化合物的回收率进行校正，提高了分析结果的准确程度。
3、本发明在质谱分析过程中，离子源的离子化效率对分析结果有显著性的影响，同时样品基质带来的基质增强效应或基质抑制作用经常使分析结果出现偏差，本发明采用内标法定量检测，通过在标准工作液制备过程中和待测动物样品中加入等量的内标化合物mqca-d4和qca-d4，利用mqca-d4和qca-d4与mqca和qca在结构上完全近似、在离子源的离子化过程中所产生的基质效应一致的特点，通过相对校正因子对mqca和qca进行定量分析，有效保证了结果可靠性。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出本发明所述3-甲基喹噁啉-2-羧酸(mqca)的标准曲线。
图2示出本发明所述喹噁啉-2-羧酸(qca)的标准曲线。
图3本发明所述猪肉阴性样品添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸的提取离子流图。
图4示出本发明所述鸡肉阴性样品中阴性样品添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸的提取离子流图。
图5示出本发明所述牛肉阴性样品中阴性样品添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸的提取离子流图。
图6示出本发明所述鱼肉阴性样品中阴性样品添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸的提取离子流图。
图7示出本发明所述猪肉阳性样品的提取离子流图。
图中，-quan代表定量离子，-qual代表定性离子
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明中所述喹乙醇代谢物为3-甲基喹噁啉-2-羧酸(mqca)和卡巴氧代谢物为喹噁啉-2-羧酸(qca)及3-甲基喹噁啉-2-羧酸-d4(mqca-d4)和卡巴氧代谢物内标为喹噁啉-2-羧酸-d4(qca-d4)的结构式如下所示：
实施例1
1、材料与仪器
1.1材料
(1)浓盐酸：14mol/l，分析纯；
(2)氯化钠：分析纯；
(3)无水硫酸镁：分析纯；
(4)乙酸乙酯：色谱纯；
(5)乙腈：色谱纯；
(6)甲醇：色谱纯；
(7)甲酸：99％，色谱纯；
(8)正己烷：色谱纯；
(9)超纯水：符合gb/t6682规定的一级水；
(10)3-甲基喹噁啉-2-羧酸、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸-d4、喹噁啉-2-羧酸-d4标准物质：纯度>99％；
(11)标准储备液的配制：准确称取适量mqca和qca标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/ml的标准储备液；
(12)标准中间液的配制：准确移取适量mqca和qca标准储备液，用甲醇稀释定容，配成10μg/ml的标准中间液；
(13)标准工作液的配制：准确移取适量mqca和qca标准中间液，用甲醇稀释定容，配成100ng/ml混合标准工作液；
(14)内标标准储备液的配制：准确称取适量mqca-d4和qca-d4标准物质，用甲醇溶解定容，配成100μg/ml的内标标准储备液；
(15)内标标准中间液的配制：准确移取适量mqca-d4和qca-d4标准储备液，用甲醇稀释定容，配成10μg/ml的内标标准中间液；
(16)内标标准工作液的配制：准确移取适量mqca-d4和qca-d4标准中间液，用甲醇稀释定容，配成1μg/ml混合内标标准工作液；
(17)1mol/l盐酸溶液：取275ml水，加入25ml浓盐酸，混匀；
(18)甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)溶液：取180ml水，加入20ml甲醇，200μl甲酸，混匀超声30min；
(19)甲醇饱和正己烷溶液：150ml正己烷和适量甲醇摇匀混合，静置待澄清分层；
(20)0.1％甲酸：1ml甲酸加入999ml超纯水，水相微孔滤膜过滤。
1.2仪器与设备：
(1)超高效液相色谱仪：shimadzu高效液相色谱仪，配备高压输液泵lc-30ad、自动进样器sil-30ac、柱温箱cto-20ac；
(2)三重四极杆质谱仪：absciexqtrap6500，配备电喷雾离子源、正离子扫描模式；
(3)氮吹仪：organomationassociateinc；
(4)涡旋混合器：ikamsa3；
(5)电子天平：sartorius1502s；
(6)移液枪：10-100μl、20-200μl、100-1000μl、500-5000μl；
(7)聚丙烯离心管：50ml，具盖；
(8)低温离心机：sigma3-18k；
(9)c18色谱柱：acquityuplcbehc18，1.7μm,2.1x100mm；
(10)微孔滤膜：0.2μmghpmembrane；
(11)进样瓶：2ml；
(12)一次性注射器：碧迪医疗器械(上海)有限公司；
(13)超纯水机：美国millipore公司milli-q系列。
2、测定方法
2.1超高效液相色谱的检测条件为：
色谱柱：acquityuplcbehc18柱：1.7μm,2.1x100mm；
流动相：a为0.1％甲酸，b为甲醇；
流速：0.2ml/min；
柱温：40℃；
进样量：10μl；
洗脱方式：梯度洗脱；
其中，所述梯度洗脱程序为
表1梯度洗脱程序
2.2三重四级杆质谱的检测条件为：
离子源：电喷雾离子源(esi源)；
扫描方式：正离子扫描；
检测方式：多反应监测(mrm)；
分辨率：单位分辨率；
电喷雾电压：5500.0v；
雾化气流气：50.0l/min；
气帘气流速：30.0l/min；
辅助气流速：50.0l/min；
离子源温度：500℃。
2.3三重四级杆质谱条件的优化
采用三重四级杆质谱在esi(+)模式下，分别对3-甲基喹噁啉-2-羧酸、喹噁啉-2-羧酸、3-甲基喹噁啉-2-羧酸-d4、喹噁啉-2-羧酸-d4的标准品溶液(浓度为1μg/ml)进行一级质谱全扫描分析，以得到分子离子，然后以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，以多反应监测模式(mrm模式)进行检测，在此基础上对锥孔电压和碰撞能量进行优化，使选定母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。优化得到的质谱检测参数如表2：
表2优化得到的质谱检测参数
*为定量离子
2.4标准曲线的制备
配制3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸浓度分别为1.0,2.5,5.0,10,20ng/ml的标准工作液，以及3-甲基喹噁啉-2-羧酸-d4和喹噁啉-2-羧酸-d4浓度均为50ng/ml的内标标准工作液，采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪测定得到3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸标准工作液各自的色谱峰和3-甲基喹噁啉-2-羧酸-d4和喹噁啉-2-羧酸-d4的色谱峰，以每种化合物的标准工作液色谱峰面积与其内标标准工作液的色谱峰面积比为纵坐标，以每种化合物的质量浓度与其内标标准工作液的质量浓度比为横坐标，作线性回归，得到3-甲基喹噁啉-2-羧酸(图1)和喹噁啉-2-羧酸的标准曲线(图2)
2.5样品的测定
2.5.1猪肉样品的测定
在猪肉阴性样品中添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸得到待测猪肉样品，其中，加标量为5.0μg/kg；具体通过如下步骤进行检测：
a、样品的前处理，包括如下步骤：
(1)称取5g待测猪肉样品，置于50ml离心管中，加入100μl1μg/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，充分涡旋1min，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测。
b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测猪肉样品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸进行内标法定量检测：
检测结果见图3。从图3可见，mqca和qca及其内标mqca-d4和qca-d4的定性定量离子的保留时间在5.0min-6.5min之间，色谱峰峰形对称，无干扰峰。根据喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的标准曲线定量，结果表明，在添加水平为5μg/kg时，待测猪肉样品中mqca和qca的回收率分别为97.6％和105.8％。
2.3.2鸡肉样品的测定
在鸡肉阴性样品中添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸得到待测鸡肉样品，其中，加标量为5.0μg/kg；具体通过如下步骤进行检测：
a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：
(1)称取5g待测鸡肉样品，置于50ml离心管中，加入100μl1μg/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测。
b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测鸡肉样品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸进行内标法定量检测。
检测结果见图4。从图4可见，mqca和qca及其内标mqca-d4和qca-d4的定性定量离子的保留时间在5.0min-6.5min之间，色谱峰峰形对称，无干扰峰。根据喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的标准曲线定量，结果表明：在添加水平为5μg/kg时，待测鸡肉样品中mqca和qca的回收率分别为97.4％和98.7％。
2.3.3牛肉样品的测定
在牛肉阴性样品中添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸得到待测牛肉样品，其中，加标量为5.0μg/kg；具体通过如下步骤进行检测：
a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：
(1)称取5g待测牛肉样品，置于50ml离心管中，加入100μl1μg/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测。
b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测牛肉样品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸进行内标法定量检测。
检测结果见图5。从图5可见，mqca和qca及其内标mqca-d4和qca-d4的定性定量离子的保留时间在5.0min-6.5min之间，色谱峰峰形对称，无干扰峰。根据喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的标准曲线定量，结果表明：在添加水平为5μg/kg时，待测牛肉样品中mqca和qca的回收率分别为105.8％和104.2％。
2.3.4鱼肉样品的测定
在鱼肉阴性样品中添加3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸得到待测鱼肉样品，其中，加标量为5.0μg/kg；具体通过如下步骤进行检测：
a、样品的前处理，并具体包括如下步骤：
(1)称取5g待测鱼肉样品，置于50ml离心管中，加入100μl1μg/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测。
b、采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测鱼肉样品中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸进行内标法定量检测。
检测结果见图6。从图6可见，mqca和qca及其内标mqca-d4和qca-d4的定性定量离子的保留时间在5.0min-6.5min之间，色谱峰峰形对称，无干扰峰。根据喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的标准曲线定量，结果表明：在添加水平为5μg/kg时，待测鱼肉样品中mqca和qca的回收率分别为105.5％和96.9％。
实施例2
本实施例所述待测样品为猪肉阳性样品，通过如下步骤进行检测：
(a)样品的前处理，包括如下步骤：
称取5g猪肉阳性样品，置于50ml离心管中，加入100μl1μg/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱检测。
(b)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述猪肉阳性样品中喹乙醇代谢物及卡巴氧代谢物进行内标法定量检测。
检测结果见图7，表明在该猪肉样品中含有3-甲基喹噁啉-2-羧酸，并采用内标法以色谱峰面积根据喹乙醇代谢物和卡巴氧代谢物的标准曲线定量，测得该猪肉样品3-甲基喹噁啉-2-羧酸的含量为13.1μg/kg。
实施例3检测方法的验证
1、线性范围
在1.0ng/ml到100ng/ml的线性范围内，以目标化合物的峰面积对其相应的质量浓度做标准曲线，其相关系数(r2)均大于0.99，表明mqca和qca在1.0-100ng/ml范围内具有良好的线性关系。
2、最低检出限和最低定量限
参照gb/t20746-2006中3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸的检出限为0.5μg/kg，在空白样品中添加0.5μg/kg的目标化合物，测试实际所得信噪比，分别为35.2和25.8，完全满足卫生限量要求。因此本方法的方法检出限设定为0.5μg/kg。
3、准确度和精确度
采用了猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉等作为基质，考察检测方法的准确度和精密度。具体步骤按实施例1进行。
猪肉中添加标准溶液浓度0.5、1.0和5.0μg/kg，每个浓度平行6次，各平行样品检测浓度见表3，mqca回收率范围分别为88.8％-114％，104.6％-115.2％，97.6％-112.3％，平均回收率分别为106.0％、109.2％和107.3％，相对标准偏差分别为8.49％、3.30％和5.02％；qca回收率范围分别为92.0％-106.4％，84.4％-107.0％，103.6％-110.1％，平均回收率分别为97.7％、95.1％和107.3％，相对标准偏差分别为5.82％、7.96％和2.37％。
表3猪肉组织中mqca和qca加标回收与精密度结果(n＝6)
牛肉添加标准溶液浓度0.5、1.0和5.0μg/kg，每个浓度平行6次，各平行样品检测浓度见表4，mqca回收率范围分别为94.0％-104.0％，95.4％-109.2％，101.9％-107.5％，平均回收率分别为99.7％、100.6％和104.7％，相对标准偏差分别为4.50％、4.86％和2.18％；qca回收率范围分别为90.4％-100.0％，92.8％-105.0％，93.3％-105.1％，平均回收率分别为94.5％、99.9％和98.7％，相对标准偏差分别为3.97％、5.38％和5.55％。
表4牛肉基质加标回收与精密度结果(n＝6)
鸡肉添加标准溶液浓度0.5、1.0和5.0μg/kg，每个浓度平行6次，各平行样品检测浓度见表5，mqca回收率范围分别为84.4％-96.4％，94.0％-100.4％，97.4％-107.8％，平均回收率分别为88.9％、98.0％和101.2％，相对标准偏差分别为5.05％、2.46％和3.85％；qca回收率范围分别为90.4％-101.2％，89.6％-98.2％，98.7％-102.7％，平均回收率分别为95.2％、95.4％和101.1％，相对标准偏差分别为4.02％、3.68％和1.41％。
表5鸡肉组织加标回收与精密度结果(n＝6)
鱼肉添加标准溶液浓度0.5、1.0和5.0μg/kg，每个浓度平行6次，各平行样品检测浓度见表6，mqca回收率范围分别为86.8％-107.6％，90.4％-107.4％，98.2％-105.5％，平均回收率分别为93.9％、98.9％和101.5％，相对标准偏差分别为7.88％、7.68％和2.54％；qca回收率范围分别为86.8％-104.8％，91.6％-106.2％，94.6％-101.6％，平均回收率分别为94.2％、96.6％和97.8％，相对标准偏差分别为8.57％、5.21％和2.89％。
表6鱼肉加标回收与精密度结果(n＝6)
对比例1比较gb/t20746-2006规定与本发明的样品前处理方法对猪肉样品检测结果影响
样品前处理方法为：(1)样品酶解：称取5.00g样品，加入10ml0.6％甲酸溶液，47℃振荡水浴1h，加入3mltris碱溶液，再加入0.3ml0.01g/ml蛋白酶水溶液，在47℃振荡水浴中酶解16-18小时。加入20ml0.3mol/l盐酸，振荡5min,在5000rpm离心15min,取上清液过滤。(2)样品净化：取滤液过oasismax固相萃取柱，3次3ml甲醇、3ml水、3次3ml0.1mol/l盐酸溶液和两次3ml甲酸水溶液(1:4)分别淋洗萃取柱，真空抽干后再用2ml乙酸乙酯淋洗，弃去淋洗液，用3ml2％甲酸-乙酸乙酯溶液洗脱3-甲基-喹噁啉-2-羧酸，45℃氮吹浓缩至干，1ml0.1％甲酸-甲醇溶液定容，过0.2μm微孔滤膜，供进样测定。(3)采用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样品中含有的3-甲基喹噁啉-2-羧酸和喹噁啉-2-羧酸进行内标法定量检测。
实验结果为，在添加水平为5μg/kg时，采用gb/t20746-2006规定的样品前处理方法所得mqca和qca的回收率分别为78.5％和80.3％，相对标准偏差分别为8.7％和7.9％，回收率降低，造成测定结果不准确。从时间上比较，采用gb/t20746-2006规定方法需要2～3个工作日才得到检测结果，而采用本发明所用方法，仅需一个工作日即可得到检测结果，大大缩短了检测时限。
对比例2比较了盐酸酸解和不用盐酸酸解对检测结果影响
对猪肉阴性样品进行添加实验，得到了待测猪肉样品，通过回收率的大小来评价酸解效果。
实验一组：称取5g待测猪肉样品，置于50ml离心管中，加入100□l1□g/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱进行内标法定量检测。
实验二组：称取5g待测猪肉样品，置于50ml离心管中，加入100□l1□g/ml的mqca-d4和qca-d4内标溶液，加8ml水，涡旋1min，放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱进行内标法定量检测。
实验结果表明，经过盐酸酸解后猪肉样品中mqca和qca的回收率分别为97.6％和105.8％。而不经盐酸酸解猪肉样品中mqca和qca的回收率分别仅为0.32％和0.58％。说明经盐酸酸解可有效地将猪肉组织样品中的mqca和qca提取出来。
对比例3比较了盐酸酸解温度对检测结果影响。
对猪肉阴性样品进行添加实验，得到了待测猪肉样品，通过回收率的大小来评价酸解效果。为评估酸解温度的影响，样品前处理过程不添加内标，外标法进行定量。
实验一组：称取5g待测猪肉样品，置于50ml离心管中，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，于室温(20℃)放置30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱进行外标法定量检测。
实验二组：称取5g待测猪肉样品，置于50ml离心管中，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，于40℃水浴30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱进行外标法定量检测。
实验三组：称取5g待测猪肉样品，置于50ml离心管中，加8ml1mol/l盐酸溶液，涡旋1min，于60℃水浴30min，再加入10ml乙酸乙酯，涡旋1min，加入3g无水硫酸镁，0.5g氯化钠，涡旋1min，8000rpm离心8min。取上清液于试管中，用氮气吹干，1ml甲醇-水-甲酸(1:9:0.001)定容，甲醇饱和正己烷除脂，0.2μm滤膜过滤后，经超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱进行外标法定量检测。
实验结果表明，在20℃、40℃、60℃三种不同的温度调节下进行酸解，猪肉样品中mqca的回收率分别为62.0％，58.3％和55.6％；qca的回收率分别为60.2％，46.6％和40.8％。即在室温下酸解mqca和qca的回收率最佳，而60℃下酸解mqca和qca的回收率最差，分析原因可能是酸解温度升高，酸解出来的杂质也随之增多，对目标化合物的干扰增大。因此实验最终选择在20℃下进行酸解。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。