一种轴向多层并行扫描显微成像方法及系统与流程

本发明涉及显微成像技术领域，特别是涉及一种轴向多层并行扫描显微成像方法及系统。

背景技术

在显微成像领域，在对较大样本进行成像时，通常采用表面浅层成像，通过压电扫描器带动物镜轴向移动，或者采用三维平移台带动样本并利用机械切削去除掉已成像的样本部分并扫描。通过这些方式，探测器顺序探测样本不同位置的信号，然后对获取到的图像进行拼接得到较大样本的整体扫描图像。然而，当待成像的样本体积进一步提高时，显微成像系统的图像采集时间将会大幅度延长。另外，在针对不同轴向平面信号的像素探测转换时，探测器需要停顿，因而存在探测停顿时间，也就存在固有的时间消耗，同样增加了整体样本的三维成像时间，降低了测试效率。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种轴向多层并行扫描显微成像方法及系统。

一种轴向多层并行扫描显微成像系统，包括：

多层信号输入系统，用于产生多层激光信号以激发样本产生不同深度的荧光信号；所述多层信号输入系统包括激光源、三块透镜、一柱面透镜、半玻片、相位调制器件、第一分束器和第一物镜，激光源发出的激光经第一透镜和第二透镜准直后，再经半玻片调整激光的偏振态，平面反射镜将所述激光的光束反射至相位调制器件上；经相位调制后，光束经柱面透镜单向聚焦为照明条带，照明条带依次历经第三透镜、第一分束器和第一物镜后在样本成像面上同时产生多个具有不同横向和轴向位移的轴向多层并行照明信号；轴向多层并行照明信号照射在样本上，激发样本产生轴向多层荧光信号；

基于梯度反射的多层信号并行探测系统，用于接收所述轴向多层荧光信号，并对所述轴向多层荧光信号进行轴向反射补偿，使所述轴向多层荧光信号能够同时清晰成像于同一个探测面；所述多层荧光信号并行探测系统包括第一分束器、第二分束器、两个物镜、梯度反射镜、面阵探测器、滤光片和相机采集卡，所述轴向多层荧光信号依次经过第一物镜、第一分束器、第四透镜、第五透镜、第二分束器和第二物镜后，入射到梯度多面反射镜后形成共面的荧光信号，所述共面荧光信号经过第二物镜、第二分束器、第六透镜和滤光片，最后同时成像在面阵探测器上形成多层图像信息；

所述多层信号输入系统的信号输出端与所述多层信号并行探测系统的信号输入端重合，所述重合处位于所述轴向多层并行照明信号在样本上的反射处附近；

载样系统，包括平移台，用于承载样本，并携带样本移动；

控制系统，用于控制样本的移动、所述轴向多层并行照明信号的产生及多层荧光信号的探测过程；所述控制系统与所述多层信号输入系统、基于梯度反射的多层信号并行探测系统和所述载样系统连接。

本发明同时提供一种轴向多层并行扫描显微成像方法，使用上述的轴向多层并行扫描显微成像系统，所述方法包括下列步骤：

s1:将样本固定在平移台上；

s2:对由所述激光源发出的照明激光进行相位调制，将调制后的照明激光经单向聚焦后，在样本处同时产生多个条带照明光束，激发样本产生多层荧光信号；

s3:通过轴向位移补偿单元对在所述样本上受激产生的多层荧光信号进行轴向位移补偿，将不同层荧光信号同时成像在同一探测器上；

s4:通过所述平移台带动所述样本移动，重复步骤s2和步骤s3，直到完成所述样本在预设范围内的扫描成像。

本发明提供的轴向多层并行扫描显微成像方法及系统通过将激光源发射的激光转化成多层照明条带光，激发样本在多层条带照明光的对应深度处产生多层荧光信号，多层荧光信号经过走向补偿后形成共面荧光信号，实现了单个探测器同时获取生物样本的多层信号，从而成倍提高显微成像系统的成像速度，缩短样本的三维成像时间。

附图说明

图1为本发明一实施例中的轴向多层并行扫描显微成像系统结构示意图；

图2为本发明一实施例中的轴向多层并行扫描显微成像方法流程图；

图3为本发明一实施例中的步骤s2详细流程图；

图4为本发明一实施例中的步骤s3详细流程图；

图5为本发明一实施例中的照明条带的位置关系示意图；

图6为本发明中梯度多面反射镜的结构原理三视示意图；

图7为本发明的方法原理示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例中提供了一种轴向多层并行扫描显微成像系统，其中轴向是指光信号的运动方向，如图1所示，至少包括基于梯度反射的多层信号输入系统、多层信号并行探测系统、载样系统和控制系统，轴向多层并行扫描显微成像系统具体包括激光源10、透镜20、一柱面透镜30、半玻片40、平面反射镜50、相位调制器60件、二个分束器70、两个物镜80、梯度多面反射镜90、面阵探测器100、滤光片200、平移台300、平台控制器(图中未示出)、相机采集卡(图中未示出)和计算机(图中未示出)，其中计算机分别与面阵探测器100、平台控制器、相机采集卡和相位调制器60件连接。透镜20包括六块，分别为第一透镜21、第二透镜22、第三透镜23、第四透镜24、第五透镜25和第六透镜26，分束器70包括两个，即第一分束器71和第二分束器72，物镜80包括两个，即第一物镜81和第二物镜82。相位调制器60件优选采用空间光调制器或相移掩膜调制器。而面阵探测器100优选采用电荷耦合器件(ccd)相机或互补金属氧化物半导体(cmos)相机。第一透镜21和第二透镜22用于准直由激光源10发出的激光，而半玻片40用于调整激光的偏振态，平面反射镜50用于将调整偏振态后的激光反射至相位调制器60件上，柱面透镜30用于将经由相位调制器60件相位调制后的激光单向聚焦为条带激光。第三透镜23、第一分束器71和第一物镜81用于将条带激光在样本成像面上同时产生多条具有不同横向和轴向位移的激光条带，即激光源发出的激光经第一透镜21和第二透镜22准直后，再通过半玻片40调整激光的偏振态，平面反射镜50将激光的光束反射至相位调制器件上，经相位调制后，光束经柱面透镜30单向聚焦为照明条带，照明条带依次历经第三透镜23、第一分束器71和第一物镜81后在样本成像面上同时产生多个具有不同横向和轴向位移的轴向多层并行照明信号，轴向多层并行照明信号照射在样本上，激发样本产生轴向多层荧光信号并输出。轴向多层并行信号进入到多层信号并行探测系统中，样本被激光条带照射受激后产生的多层荧光信号，依次经由第一物镜81、第一分束器71、第四透镜24、第五透镜25、第二分束器72和第二物镜82后，入射到梯度多面反射镜90中。

基于梯度反射的多层信号输入系统用于产生多层激光信号以分别激发样本的不同深度，以生成样本上不同深度的轴向多层荧光信号，其包括激光源10、第一透镜21、第二透镜22和第三透镜23、柱面透镜30、半玻片40、平面反射镜50、相位调制器60、第一分束器71和第一物镜81。

多层信号并行探测系统用于接收轴向多层荧光信号，并对轴向多层荧光信号进行轴向反射补偿，使轴向多层荧光信号能够同时被同一个探测面探测到，其具体包括第一分束器71、第二分束器72、两个物镜80、第四透镜24、第五透镜25、第六透镜26、梯度反射镜27、面阵探测器28、滤光片200和相机采集卡。

多层信号输入系统的信号输出端与多层信号并行探测系统的信号输入端重合，该重合处位于轴向多层并行照明信号在样本上的反射处附近，第一分束器71和第一物镜81为多层信号输入系统和多层信号并行探测系统共用。

载样系统包括平移台300，其用于固定样本并带动样本移动，可优选采用三维电动平移台，用于固定样本并带动样本在预设三维空间内移动，实现一定三维空间范围内的样品测量。

控制系统包括计算机，用于控制样本的移动、轴向多层并行照明信号的产生以及多层荧光信号的探测过程，因此控制系统与机遇梯度反射的多层信号输入系统、多层信号并行探测系统和载样系统均连接，并对其进行控制。

梯度多面反射镜90的反射面具有设定的横向间距和轴向间距，以确保经其反射的多层荧光信号具有预定横向距离和轴向距离，便于区分和计算。梯度多面反射镜90可由三面矩形平面反射镜组成，每两个反射镜成垂直连接。经过梯度多面反射镜90梯度反射后的多层荧光信号形成为共面的荧光信号，该共面的荧光信号依次经过第二物镜82、第二分束器72、第六透镜26和滤光片200后同时成像在面阵探测器100上，最终反映出样品被照射面上的多层图像信息。优选的，第一物镜81的数值孔径不小于第二物镜82的数值孔径，数值孔径用以衡量该系统能够收集的光的角度范围。

在其中一个实施例中，梯度多面反射镜90中的单个反射面为平面，而反射面的轮廓形状为长方形。采用曲面型的反射面可针对特殊形状的样品，其适应性不及平面反射面强，而将反射面的轮廓形状设置为长方形则便于设备的生产制造。需要指出的是，梯度多面反射镜90的反射镜面垂直于轴向多层并行信号的轴向布置，不同层信号在对应反射面上反射。不同照明条带的激发深度不同，产生的激发光束的轴向深度自然也不同，同一深度的信号为同一层，因此存在多层信号的轴向位移差。相邻反射面的轴向位移差是轴向多层并行信号中对应相邻信号的轴向位移间距的一半，反射平面间的中心位置间隔与对应信号的横向距离相等。

作为一个优选的方案，其中第四透镜24和第五透镜25组成透镜对，而该透镜对的放大比m与第一物镜81和第二物镜82的介质折射率n1和n2满足关系：m＝n2/n1。采用上述比例关系的透镜对和物镜组能够确保激光的良好聚焦，也能够确保信号在传输过程中的保真度。

本发明相应提供了一种轴向多层并行扫描显微成像方法，如图2所示，使用前述的轴向多层并行扫描显微成像系统进行操作，成像方法包括下列步骤：

s1:将样本固定在平移台300上。平移台300可选用三维电动平移台，可对样品位置进行连续三维方向的平移。

s2:对由激光源10发出的照明激光进行相位调制，将调制后的照明激光经单向聚焦后，在样本上同时产生多个条带照明光束。

s3:通过轴向位移补偿单元对在样本上受激产生的多层荧光信号进行轴向位移补偿，将不同层荧光信号同时成像在同一探测器上。

s4:通过平移台300带动样本移动，重复步骤s2和步骤s3，直到完成样本在预设范围内的扫描成像。完成一个区域的扫描成像之后，就转移至相邻位置再进行扫描成像，当遍历完整个样本的所有区域之后，就能够得到该样本的完整三维扫描图像信息。

本发明提供的轴向多层并行扫描显微成像方法在扫描时不需要将探测器进行停顿，整个过程连续不断地进行，获取到多层扫描图像信息之后能够进行连续实时拼接，为扫描较大体积的样本提供了方便，降低了整体样本的三维成像时间，提高了测试效率。

优选的，在进行扫描限位成像时，需要对样本由表及里的多个层次的深度进行扫描，也即有多个深度的焦点，因而多个照明条带的聚焦深度依次相对于物镜具有预定距离的轴向偏移，该轴向偏移与样本的三维图像间隔相匹配，预定距离一般为1～100微米。进一步的，如图3所示，上述的轴向偏移的确定过程包括如下步骤：

s21:将样本更换为平面反射镜50，并将其置于第一物镜的焦平面位置。

s22:轴向移动平面反射镜50至轴向偏移一半的位置。

s23:相位调制器60件上加载偏移参量为k的相位图案，探测器记录对应的图像。

s24:重复步骤s23，在-100至100范围内加载偏移参量k，直至图像中探测信号的半高全宽最窄，将对应的偏移参量km确定为产生预设轴向偏移的最佳调制参量。

而当进行荧光成像时，测量过程和实际成像过程存在光学原理上的差异，因此需要在获得测量结果后，实际成像时，加载相反数参量进行调制，因而此时加载对应的偏移参量为-k的相位图案进行相位调制。

作为一个优选的方案，上述轴向多层并行扫描显微成像系统中的轴向位移补偿单元由第一物镜81、第二物镜82、第四透镜24、第五透镜25和梯度多面反射镜90组成，多层荧光信号依次通过第一物镜81、第四透镜24、第五透镜25和第二物镜82。为便于对技术特征进行描述，定义第一物镜81和第二物镜82的溶液介质折射率分别为n1和n2，而第四透镜24和第五透镜25的焦距分别为f1和f2，使f1/f2＝n1/n2。

在使用轴向多层并行扫描显微成像系统进行扫描显微成像操作时，需要调整梯度多面反射镜90的反射面的横向间距和轴向间距，以便于对收集到的分层图像进行计算还原，如图4所示，该两项参数具体通过下列步骤测量：

s31:将梯度多面反射镜90替换为第一平面反射镜50，并且在第一物镜81的焦平面处放置第二平面反射镜50。

s32:轴向移动第一平面反射镜50直至多层信号中的一层信号被探测器清晰探测到，并记录此时的图像。

s33:重复步骤s32，依次记录多层信号中的每层图像，并记录对应的第一平面反射镜50的移动间隔，确定该移动间隔为梯度反射镜反射面的轴向间隔。

s34:将每层图像叠加到同一张图像中，选择每层信号的中心位置为测量位置，分别测量每层信号的横向位置，根据横向位置除以系统放大倍率后得到横向间距。选择每层信号的中心位置以便于识别和确定测量基准。

为便于理解本发明所提供的扫描限位成像方法及系统，现列举实例以说明：

如图5和图6所示，相位调制后，在样本成像面产生三个照明条带1、2和3。条带之间的轴向间隔分别为δz1和δz2，横向间隔分别为δx1和δx2。m1、m2和m3分别梯度反射镜的三个反射面，反射面的轴向间隔分别为1/2δz1和1/2δz2。在横向上，反射面中心位置的间隔分别为δx1和δx2。其中，照明条带1、2和3照射到样本上激发出荧光信号1、2和3，荧光信号1、2和3分别经反射面m1、m2和m3反射。如图7所示，相位调制产生的三维间隔的条带信号111、112和113，其分别是样品11上的a层、b层和c层中的一部分图像信息，激发样本对应产生一组荧光信号，该组荧光信号经系统的轴向偏移校正单元后，同时聚焦在面阵探测器100上，对应探测器不同横向位置可分别提取不同层级的轴向信号，即为对应的111′、112′和113′，其反映的是样品11上三个不同层的样貌a、b和c中的一部分图像信息。在扫描完成单层平面的时间间隔内即可进行条带拼接，可同时获得样本由表及里的三层信号，得到由成像设备获取到的101层、102层和103层的a、b和c的样貌信息。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。