一种多焦点光切片荧光显微成像方法和装置与流程

本发明涉及光学成像技术领域，具体地说，涉及一种多焦点光切片荧光显微成像方法和装置。

背景技术

十六世纪末期，世界上首个光学显微镜诞生，它极大地拓展了人们对微观世界的认识，在之后的几个世纪里，光学显微镜被不断地改进，成像速度、分辨率、灵敏度等方面都得到了长足的发展，在生物成像领域发挥着越来越重要的作用。而随着生物技术的高速发展，需要对生理过程具有更加深刻的理解，这也对3d实时成像技术提出了更高的要求。但是，3d实时成像技术的发展，也面临着许多挑战——成功的3d实时成像技术，需要同时达到高空间分辨率、高成像速度、良好的光切片能力、低光损伤和光漂白能力。

目前已经有了许多3d实时成像的技术，比如宽场显微技术、共聚焦显微技术、双光子荧光显微技术、以及光切片荧光显微技术。其中，光切片荧光显微技术，由于其高速、低光漂白性和成像的无创性等优势，在这几年里得到了极其迅速的发展。

由于光切片荧光显微技术的无创性，它的在生物成像领域具有十分重要的地位。但是，由于照明光切片的扩散特性，光切片荧光显微技术能够成像的视场范围十分有限，这限制了它在大样品成像上的应用。为了解决这个问题，有人提出将视场拼接技术与光切片荧光显微相互结合，这样虽然可以成功地扩展光切片荧光显微镜的成像范围，但是这需要在系统中增加电动位移平台，这增加了实现的成本和难度，而且需要对样品进行多次成像后拼接，这极大地降低了成像速度，无法观察一些速度较快的生理过程。

相较而言，对光束进行调制整形，改变光切片的形状，来减缓其扩散，能够在保证成像速度的情况下，扩展视场。贝塞尔光束和艾利光束在光切片荧光显微技术中的应用，就是对这种方案的成功实施，但是这两种光束形成的光切片，会产生较为严重的旁瓣，造成严重的背景噪声，需要使用相关算法，对所得到的图像进行恢复处理。

技术实现要素：

本发明的目的为提供一种多焦点光切片荧光显微成像方法，利用该方法可以在不增加背景噪声的情况下，扩大光切片荧光显微镜的视场范围。

本发明的另一目的为提供一种实现上述方法的光切片荧光显微成像装置，该装置可用于实现上述方法，通过相位掩模板对入射的光束进行相位调制，产生一个具有多个焦点的光束，这些焦点之间的间距基本相等。然后，通过振镜扫描，形成不连续的光切片。随后，通过调节电驱动可变焦凹透镜，使光束的聚焦点沿着照明物镜光轴方向前后来回移动，通过这样的移动，使振镜扫描形成的光切片互相连接，形成沿着照明光轴方向，扩散更慢的虚拟的光切片。使形成的光切片不仅有较大的视场范围，而且在聚焦的位置背景光较弱，对样品进行成像时，可以更好地消除背景噪声。

为了实现上述目的，本发明提供的多焦点光切片荧光显微成像方法包括以下步骤：

1)激光经过相位调制后，形成一系列沿着照明光轴方向且具有相同间距的多焦点光束；

2)沿着x轴方向扫描光束，并沿着y轴方向前后移动光束，得到一个沿着y方向具有一定成像范围的光切片；

3)沿着z轴方向，收集荧光样品发出的荧光，得到样品在该轴向位置的二维的光强信号图像。

4)沿着z轴移动样品，重复步骤3)得到多幅二维光强信号图像，对多幅二维光强信号图像进行三维重构，得到荧光样品的三维成像信息。

上述技术方案中，x轴方向是垂直于照明光轴和检测光轴的方向，y轴方向是沿着照明光轴的方向，z轴方向是沿着检测光轴的方向，这三个方向两两垂直，构成了三维直角坐标系。步骤2)中，光束沿着x轴方向扫描，使光束形成不连续的光切片。通过步骤1)和步骤2)会产生一个虚拟的光切片，相较于传统高斯光束形成的光切片，这种光切片沿着照明光轴方向扩散得更慢，而且在聚焦的范围内，背景光也较弱，因此，可以在更大的视场范围内，获得背景噪声更低的图像。

具体的方案为步骤1)中，为了得到具有多个聚焦点的光束，需要先使激光转换为径向偏振光，然后再对该径向偏振光进行相位调制。

另一个具体的方案为，步骤1)中所使用的相位调制函数为：

其中，(r,θ)表示光束上某点的极坐标，r为该点与光轴的归一化距离，θ为光束垂直于光轴剖面的极坐标矢量与激光出射光轴的夹角。

另一个具体的方案为，步骤2)中，前后移动光束，使焦点沿着y轴移动形成光线，光束移动的范围为多焦点光束的任意两个焦点之间的距离。

为了实现上述另一目的，本发明提供的多焦点光切片荧光显微成像装置，包括形成光切片的照明系统、承载荧光样品的样品台、检测荧光样品发出荧光的检测系统和一处理器，照明系统包括沿光路依次布置的：激光器；将激光光束转变为径向偏振光的径向偏振转换器；对径向偏振光进行相位调制并使其转化为多焦点光束的相位掩模板；使照射到荧光样品上的光束沿着x轴方向扫描的单轴振镜；以及使焦距发生连续变化的电驱动可变焦凹透镜；处理器用于控制电驱动可变焦凹透镜的焦距发生连续变化和控制样品台以固定步长沿z轴方向移动，并对检测系统收集的多幅二维光强信号图像进行重构，得到荧光样品的三维成像信息。

上述技术方案中，激光光束经过相位调制后，会形成多个聚焦点，这些聚焦点沿着x轴扫描，并沿着y轴前后移动，来形成一种虚拟的大视场光切片。荧光样品被这种光切片激发，产生荧光，被检测系统收集，得到一幅含有荧光样品在xy平面上信息的二维图像。然后，样品台被处理器控制，沿着z轴移动，得到多幅二维图像，重建得到荧光样品的三维成像结果。相较于传统的光切片荧光显微镜，本方案提供的装置产生的光切片，在y轴方向更不容易发生扩散、并且在聚焦范围的背景光更弱，能够产生更大的视场、并且产生的背景噪声更弱。

具体的方案为，为了获得具有多个焦点的光束，本发明所使用的相位掩模板上的调制函数为：

其中，(r,θ)表示光束上某点的极坐标，r为该点与光轴的归一化距离，θ为光束垂直于光轴剖面的极坐标矢量与激光出射光轴的夹角。

另一个具体的方案为，检测系统包括沿z轴方向依次布置的检测物镜、滤光片、管透镜和ccd相机。其中，检测物镜用于收集荧光样品被激发出的荧光，滤光片用于滤除杂散光，管透镜用于将荧光聚焦到ccd相机上，ccd相机用于记录感光面上的荧光信号，并将荧光信号传递给处理器。

另一个具体的方案为激光器和径向偏振转换器之间设有对激光器所发出的激光光束进行扩束的扩束透镜；相位掩模板与所述的单轴振镜之间设有用于调整激光光束大小的第一凸透镜组；电驱动可变焦凹透镜与样品台之间依次设有第二凸透镜组和照明物镜。

另一个具体的方案为，电驱动可变焦凹透镜焦距变化范围为多焦点光束的任意两个焦点之间的距离。通过焦距的变化，实现光束在y轴方向上前后移动，得到一个视场范围更宽的光切片。电驱动可变焦凹透镜通过处理器控制，实现焦距的连续变化。

本发明的原理如下：

传统的光切片荧光显微技术中，使用普通的高斯光束经过柱面镜的聚焦或者振镜的扫描形成光切片，这种方式形成的光切片，在y轴方向上会扩散较快，只有在聚焦的一小部分能够有效地激发样品的荧光，视场范围十分有限。

在本发明中，通过相位掩模板的调制，形成多焦点的光束，然后通过电驱动焦距可变凹透镜的焦距改变，使光束在y轴方向上前后移动，在快速移动过程中，几个焦点互相连接，形成一个y轴方向上可用范围更大的光切片。通过这种方法形成的光切片，在很长一段距离上都聚焦良好，极大地扩大了光切片荧光显微镜的视场范围，而且这种良好聚焦的光切片，也可以很好地抑制背景噪声。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明极大地提高了光切片荧光显微技术的视场范围，并降低了成像的背景噪声。

附图说明

图1为本发明实施例的光切片荧光显微成像装置的结构示意图；

图2为本发明实施例的相位掩模板的相位分布示意图；

图3为本发明实施例的激光光束经过相位掩模板后形成的多焦点光束在yz平面上的光强分布；

图4(a)为本发明实施例最终得到的光切片在yz平面上的光强分布图；(b)为传统的高斯光切片在yz平面上的光强分布图；

图5为本发明实施例和传统光切片荧光显微技术的系统点扩散函数沿y轴向归一化光强分布曲线的对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合实施例及其附图对本发明作进一步说明。

装置实施例

参见图1，本实施例的多焦点光切片荧光显微成像装置包括，激光器1，扩束透镜2，径向偏振转换器3，相位掩模板4，第一凸透镜组(凸透镜5、凸透镜6)，单轴振镜7，电驱动可变焦凹透镜8，第二凸透镜组(凸透镜9、凸透镜10)，照明物镜11，样品台12，检测物镜13，滤光片14，管透镜15，ccd相机16，计算机17。

本发明的装置实施例可以分为四个部分：产生照明光切片的照明系统、承载样品的样品台12、检测样品发出的荧光的检测系统以及处理器，本实施例的处理器为计算机17。

其中，照明系统包括沿光路依次布置的：激光器1，扩束透镜2，径向偏振转换器3，相位掩模板4，凸透镜5，凸透镜6，单轴振镜7，电驱动可变焦凹透镜8，凸透镜9，凸透镜10以及照明物镜11。

激光器1发出激光；扩束透镜2对激光进行扩束准直；径向偏振转换器3将入射的光束转换为径向偏振的光束；相位掩模板4对径向偏振的光束进行相位调制，使其形成具有多个焦点的光束，相位掩模板4上的相位分布如图2所示，它的调制函数为：

其中，(r,θ)表示光束上某点的极坐标，r为该点与光轴的归一化距离，θ为光束垂直于光轴剖面的极坐标矢量与激光出射光轴的夹角。

凸透镜5和凸透镜6对光束大小进行调节；单轴振镜7反射光束，可以通过旋转，使光束在样品处沿着x轴方向扫描；电驱动可变焦凹透镜8被计算机17控制，焦距发生改变，使照射在样品上的光束沿着y轴方向前后移动；照明物镜11将激发光束投射到荧光样品上。

承载样品的样品台12能够被计算机17控制沿着z轴方向以固定的步长移动。

检测系统包括沿z轴方向依次布置的：检测物镜13，滤光片14，管透镜15和ccd相机16。

检测物镜13用于收集荧光样品被激光激发发出的荧光；滤光片14用于滤除收集得到的杂散光；管透镜15用于将收集到的荧光聚集到ccd相机16上；ccd相机16用于记录荧光信号，并将信号传递到计算机17上。

计算机17一方面对ccd相机16记录的多幅二维荧光信号进行重构，重构出三维的荧光样品的成像结果；另一方面控制承载荧光样品的样品台12，使其以固定的步长沿着z轴移动，再一方面控制电驱动可变焦凹透镜8，使其焦距连续变换，变换的范围为得到的多焦点光束中，两个焦点之间的距离。

采用上述装置对荧光样品进行三维成像的过程如下：

激光器1中发出的激光光束，经过扩束透镜2被扩束准直之后，经过径向偏振转换器3被转换为径向偏振光，然后再通过相位掩模板4进行相位调制，相位掩模板4上的相位分布如图2所示，经过该相位调制后，光束变为多焦点的聚焦光束。

该多焦点的光束经过凸透镜5和凸透镜6对光束的大小调整后，照射到单轴振镜7上，被单轴振镜7反射。反射后的光束，经过电驱动可变焦凹透镜8的散射，然后再被凸透镜9和凸透镜10聚焦扩束，被照明物镜11投射到荧光样品(放置于承载荧光样品的样品台12)上。

多焦点的激发光束在yz截面上的光强分布如图3所示，通过单轴振镜7旋转和电驱动可变焦凹透镜8的焦距变换，分别在x轴和y轴上扫描，得到虚拟的大视场光切片，该光切片的在yz截面上的光强分布如图4(a)所示。

荧光样品被上述光切片激发，发出荧光，被检测物镜13收集，再经过滤光片14滤光，然后被管透镜15聚焦到ccd相机16上，ccd相机16将记录的二维荧光信号传递到计算机17上。

计算机17控制着承载荧光样品的样品台12沿着z轴方向以固定的步长移动，在每个轴向位置都得到一幅具有荧光样品二维信号的图像。将多幅图像重建，得到样品的三维成像结果。

为了验证本实施例所用的方法对光切片荧光显微技术视场范围的扩大，对本实施例中得到的光切片和传统的高斯光切片，在yz截面上的光强分布进行对比，如图4所示，(a)为本发明得到的光切片，(b)为传统的高斯光切片，通过对比可知，在y轴方向，本发明得到的光切片的扩散要慢得多。

通过将图5中在y轴方向上归一化光强分布的曲线对比，可以看出，本发明所用的方法极大地扩大了光切片荧光显微方法，通过曲线中的半高全宽(fwhm)计算，本发明将光切片荧光显微技术的视场扩大了八倍。

方法实施例

本实施例的多焦点光切片荧光显微成像方法基于上述装置实施例中的光切片荧光显微成像装置实现，其包括以下步骤：

1)激光经过相位调制后，形成一系列沿着照明光轴方向且具有相同间距的多焦点光束；

2)沿着x轴方向扫描光束，并沿着y轴方向前后移动光束，得到一个沿着y方向具有一定成像范围的光切片；

3)沿着z轴方向，收集荧光样品发出的荧光，得到样品在该轴向位置的二维的光强信号图像。

4)沿着z轴移动样品，重复步骤3)得到多幅二维光强信号图像，对多幅二维光强信号图像进行三维重构，得到荧光样品的三维成像信息。

本实施例中，x轴方向是垂直于照明光轴和检测光轴的方向，y轴方向是沿着照明光轴的方向，z轴方向是沿着检测光轴的方向。这三个方向，两两相互垂直，构成三维直角坐标系。

步骤1)中相位调制的调制函数为其中，

(r,θ)表示光束上某点的极坐标，r为该点与光轴的归一化距离，θ为光束垂直于光轴剖面的极坐标矢量与激光出射光轴的夹角。