本发明涉及一种三磷酸腺苷电致化学发光测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术：
三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，atp）是生物各项生命活动所需能量的提供者和生物体内能量代谢和转换的重要枢纽。三磷酸腺苷的主要作用是为机体提供能量，参与体内脂肪、糖、蛋白质和核酸的代谢，在维持生物体的正常机能上起着无可替代的作用。因此，在临床检测中，三磷酸腺苷被作为很多疾病的生物标志物。目前，三磷酸腺苷的检测方法有高效液相色谱法、电泳法、质谱法和荧光素酶法等，但是以上方法存在操作复杂、仪器昂贵、灵敏度高等问题。因此，发展高灵敏、准确、快速、价廉的atp检测方法对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程、进行药物敏感实验以及食品卫生监控都有非常重要的意义。
电致化学发光（electrochemiluminescence，ecl）生物分析是化学发光、电化学、生物分析、微电子技术以及传感技术相结合的最新产物。该分析方法具有操作简单、灵敏度高、选择性好、线性范围宽及易控制等诸多优良的性能特点，已被广泛应用于临床诊断、免疫、药物、食品质量及其它物质的测定。功能化金纳米团簇作为新型纳米发光体，其具有无毒、水溶性好、比表面积大、表面易修饰及特殊光电性质等特点，己广泛应用于生物医药、临床分析、传感检测和催化等领域。本课题组已通过纳米尺度调控成功制备了高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并在此基础上建立了一系列新型高效电致化学发光生命分析平台，成功用于实际样品中肿瘤标志物、神经递质、细胞内重要的调节代谢产物等物质的高灵敏、快速、高选择性的检测，该检测平台对实际样品检测比目前报道的方法检测限低了4-5个数量级，具有十分广阔的临床应用前景。
本发明以金纳米团簇为电致化学发光探针，以二氧化锰纳米片为猝灭剂，基于三磷酸腺苷与适配体的特异性结合，阻碍脱氧核酶的产生，减少氧化态谷胱甘肽的生成，使得金纳米团簇探针的电致化学发光信号恢复，从而建立一种高灵敏、高选择、快速的实现对三磷酸腺苷含量的测定新方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种以金纳米团簇为电致化学发光探针的三磷酸腺苷电致化学发光测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种三磷酸腺苷电致化学发光测定方法，其特征是：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料形成二氧化锰/金纳米团簇修饰电极，将其作为电致化学发光猝灭剂；将适配体和sn(iv)原卟啉ix混合，形成脱氧核酶，加入谷胱甘肽溶液中，形成的脱氧核酶催化氧化谷胱甘肽，将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液反应后，采集修饰电极的电致化学发光信号，将该信号值作为空白值；将三磷酸腺苷、适配体、sn(iv)卟啉ix及谷胱甘肽混合，适配体与三磷酸腺苷结合，不产生脱氧核酶，将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，谷胱甘肽与电极表面二氧化锰发生氧化还原反应，采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现三磷酸腺苷的测定。
所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4v~-2v范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/l硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述金纳米团簇为功能化修饰金纳米团簇，采用n-乙酰化-l-半胱氨酸-金纳米团簇或牛血清白蛋白-金纳米团簇。
所述在电极表面修饰二氧化锰纳米材料的方法为电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在1:1v/v的kmno4-h2so4溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1v~-0.5v，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干。
所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或tris-hcl缓冲溶液，所用电解质为kcl或kno3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s，光电倍增管高压设置为600~800v，检测电致化学发光辐射信号。
所述适配体的序列为：gggatgggcacctgggggagtattagcggaggaaggttccaggtggggttggg，浓度为1×10−6mol/l~1×10−5mol/l。
所述sn(iv)原卟啉ix浓度为1×10−6mol/l~2×10−5mol/l，谷胱甘肽浓度为0.1mol/l。
采集修饰电极的电致化学发光信号的磷酸盐缓冲溶液或tris-hcl缓冲溶液的ph值为7.4，过硫酸根离子浓度为0.1mol/l。
电致化学发光强度变化值与三磷酸腺苷浓度的对数值在3.6×10-12~3.6×10-3mol/l的范围内呈良好的线性关系，检测限为1.4×10-12mol/l。
具体地说，为了实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：将金纳米团簇修饰在玻碳电极上，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，进而在电极表面电沉积二氧化锰纳米材料；将适配体和sn(iv)卟啉ix混合，反应后加入谷胱甘肽，形成的脱氧核酶催化氧化谷胱甘肽，进而将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，反应后，采集修饰电极的电致化学发光信号，将该信号值作为空白值；将三磷酸腺苷和适配体混合反应，再加入sn(iv)卟啉ix，最后加入谷胱甘肽，适配体与三磷酸腺苷结合，不产生脱氧核酶，将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，谷胱甘肽与电极表面二氧化锰发生氧化还原反应，采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现三磷酸腺苷的测定。
上述金纳米团簇探针由以下方法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加不同负电位电压，进行恒电位还原处理，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在一定浓度的硼氢化钠溶液反应一定时间，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述的金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，如：n-乙酰化-l-半胱氨酸-金纳米团簇，牛血清白蛋白-金纳米团簇等。
所述的在电极表面电化学沉积二氧化锰纳米材料的方法为：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，恒电位沉积制得二氧化锰纳米材料修饰电极。
所述的电致化学发光信号由以下方法采集：采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600v~800v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
本发明所述的一种基于金纳米团簇为电致化学发光探针的三磷酸腺苷测定方法，包括如下步骤：1）将玻碳电极用al2o3粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗，n2吹干；2）将金纳米团簇探针溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇探针修饰玻碳电极，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步制得二氧化锰纳米材料/金纳米团簇修饰电极；3）取适配体和sn(iv)卟啉ix溶液，混合均匀，室温反应后加入谷胱甘肽，形成的脱氧核酶催化氧化谷胱甘肽，进而将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，室温反应后取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；采集修饰电极的电致化学发光信号作为空白值；4）取不同浓度的三磷酸腺苷和适配体溶液，混合反应后再加入sn(iv)卟啉ix，而后加入谷胱甘肽，将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液，未氧化的谷胱甘肽与电极表面二氧化锰发生氧化还原反应，取出工作电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；检测工作电极表面产生的电致化学发光信号；4）以电致化学发光信号变化值对三磷酸腺苷浓度的对数值作图得到标准曲线，在三磷酸腺苷浓度为3.6×10-12~3.6×10-3mol/l的范围内三磷酸腺苷浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为1.4×10-12mol/l。
上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为kcl或kno3，浓度为0.01~1mol/l。
本发明采用的具体技术方案如下：
（一）n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇的制备
n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇合成步骤如下：将浓度为0.1~0.8mol/l的氢氧化钠与浓度为0.01~0.1g/l氯金酸溶液加入到浓度为0.02~0.18mol/l的n-乙酰-l-半胱氨酸溶液中，混匀后置于20~70℃恒温水浴恒温反应0~3.5小时。待反应结束后透析纯化处理，得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后可得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇材料粉末。
（二）金纳米团簇修饰电极的制备
将玻碳电极用1.0μm、0.3μm和0.05μm的al2o3粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl金纳米团簇水溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇修饰玻碳电极。
（三）金纳米团簇探针制备
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加负电位电压（-1.4v~-2v范围内），进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针。
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/l硼氢化钠溶液反应5~30min（优选0.1mol/l硼氢化钠溶液反应5min），得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
（四）二氧化锰纳米材料修饰方法
采用电化学沉积法修饰二氧化锰纳米材料，具体步骤如下：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.1v~-0.5v，沉积时间为100s~600s，优选300s，之后用双蒸水冲洗干净，氮气吹干备用。
（五）电致化学发光信号采集方法
将电极抛光，再依次放入hno3溶液、无水乙醇和去离子水中超声清洗，n2吹干。采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600v~800v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
所述电极为玻碳电极、丝网印刷电极或ito电极等。上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为kcl或kno3，浓度为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。
（六）三磷酸腺苷的测定
取hepes缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l），依次加入适配体溶液（终浓度为1×10−6mol/l~1×10−5mol/l）和sn(iv)卟啉ix溶液（终浓度为1×10−6mol/l~2×10−5mol/l），室温反应20min，再加入谷胱甘肽溶液（终浓度为0.1mol/l），反应10min；将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，室温反应后取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；采集修饰电极的电致化学发光信号作为空白值；4）取不同浓度的三磷酸腺苷于hepes缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l）中，加入适配体溶液（终浓度为1×10−6mol/l~1×10−5mol/l），室温反应30min，再加入sn(iv)卟啉ix溶液（终浓度为1×10−6mol/l~2×10−5mol/l），室温反应20min，加入谷胱甘肽溶液（终浓度为0.1mol/l），反应10min；将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液8min，取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；检测工作电极表面产生的电致化学发光信号；4）以电致化学发光信号对三磷酸腺苷浓度作图得到标准曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以高量子产率金纳米团簇探针为电致化学发光材料，以纳米二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，基于三磷酸腺苷与适配体的特异性结合，阻碍脱氧核酶的产生，减少氧化态谷胱甘肽的生成，使得金纳米团簇探针的电致化学发光信号恢复，从而建立一种操作简单、成本低、灵敏度高、准确性和选择性好的三磷酸腺苷含量的测定新方法，且检测线性范围宽（3.6×10-12~3.6×10-3mol/l），检测限低（1.4×10-12mol/l），因而具有良好的市场价值。
附图说明
图1为金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图2为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图3为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极检测1.0×10-6mol/l三磷酸腺苷的电致化学发光-时间曲线图。
图4为电致化学发光强度变化与三磷酸腺苷浓度对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
本发明所用的适配体（aptamer-atp，序列为：gggatgggcacctgggggagtattagcggaggaaggttccaggtggggttggg，takara公司），sn(iv)原卟啉ix（sn(iv)protoporphyrinix，sigma-aldrich公司）为现有技术产品。
实施例1
往4ml浓度为0.08mol/l的n-乙酰-l-半胱氨酸溶液中加入0.6ml浓度为0.5mol/l的氢氧化钠与0.4ml浓度为20mg/ml氯金酸溶液，混匀后置于37℃恒温水槽中孵育3h。反应结束后的反应液用截留分子为3500的透析袋进行透析纯化处理，得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇粉末。
实施例2
将直径3mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm和0.05μm的al2o3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl实施例1制备的n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，得n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇修饰玻碳电极。将n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5min，得到金纳米团簇探针修饰电极。将上述金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。
实施例3
将直径3mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm和0.05μm的al2o3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl实施例1制备的n-乙酰-l-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用计时电流法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.2v，沉积时间为300s，所得到的电极为二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极，之后用双蒸水冲洗干净，n2气轻轻吹干备用。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图2）。
实施例4
取100μmol/l适配体溶液3μl于134μl4-羟乙基哌嗪乙磺酸;n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-2-乙烷磺酸（hepes）缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l）静置30分钟，再加入150μmol/lsn(iv)卟啉ix溶液3μl，室温反应20min，再加入1.50mol/l谷胱甘肽10μl，反应10min；将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，室温反应后取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；以上述吹干的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应8min后，，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到的电致化学发光信号值与未插入反应液的二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极电致化学发光信号值一致。
实施例5
取10μl三磷酸腺苷溶液（15μmol/l）与124μlhepes缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l）混合，加入100μmol/l适配体溶液3μl室温反应30min后，加入150μmol/lsn(iv)卟啉ix溶液3μl，室温反应20min，再加入1.50mol/l谷胱甘肽10μl，反应10min；将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，室温反应后取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；以上述吹干的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应8min后，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。分别检测不同浓度的三磷酸腺苷条件下工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图3）。
实施例6
取不同浓度的三磷酸腺苷溶液10μl与124μlhepes缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l）混合，加入100μmol/l适配体溶液3μl室温反应30min后，加入150μmol/lsn(iv)卟啉ix溶液3μl，室温反应20min，再加入1.50mol/l谷胱甘肽10μl，反应10min；将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，室温反应后取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；以上述吹干的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应8min后，，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。分别检测不同浓度的三磷酸腺苷条件下工作电极表面产生的电致化学发光信号，在三磷酸腺苷浓度为3.6×10-12~3.6×10-3mol/l的范围内三磷酸腺苷浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为1.4×10-12mol/l（见图4）。
实施例7
取新鲜的血清样品3µl，加入hepes缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l）至200µl，取10µl稀释后血清样品至124μlhepes缓冲液（ph=6.0，0.25mmol/l）中，加入100μmol/l适配体溶液3μl室温反应30min后，加入150μmol/lsn(iv)卟啉ix溶液3μl，室温反应20min，再加入1.50mol/l谷胱甘肽10μl，反应10min；将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述溶液，室温反应后取出电极，用双蒸水冲洗干净，n2吹干；以上述吹干的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应8min后，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。分别检测各样品条件下工作电极表面产生的电致化学发光信号，通过标准曲线进行定量，获得样品中三磷酸腺苷的含量。采用标准加入法得到本发明所述的方法检测血清样品中三磷酸腺苷的回收率为95.8%~108.5（表1）。
表1为血清样品中三磷酸腺苷的检测结果。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。