一种检测食品中亚硫酸盐含量的试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及利用颜色和荧光双重可视化信号变化效果检测亚硫酸钠的反应试剂盒，以及该试剂盒中主要作用试剂的合成方法以及试剂盒的制作工艺。

背景技术：

亚硫酸盐是食品工业上常用的漂白剂和防腐剂，其作为食品添加剂在食品中发挥的作用主要有以下几个方面：(1)防止食品的酶促褐变与非酶褐变，使食品的外观光亮、洁白；(2)抑制微生物生长从而延长食品的保质期；(3)抑制食品中氧化酶的活性，防止氧化酶引起营养成分破坏和色变；(4)与食品中含有的有色物质结合，因其还原性起到漂白作用。

然而，随着研究的逐步深入，亚硫酸盐的毒性日益受到关注。它的毒性主要表现在以下几个方面：(1)亚硫酸盐能够与氨基酸、蛋白质等物质发生反应，还能与多种维生素结合将其裂解为其它产物，从而严重破坏食品中的营养物质，降低食品的营养价值(2)长期接触低浓度的亚硫酸盐可导致头痛、头昏、全身乏力，严重时会引起慢性咽喉炎、支气管炎、嗅觉及味觉减退等症状。(3)如果是动物长期吃含有亚硫酸盐的食物，会出现神经发炎、骨髓萎缩等不良的症状，这会对动物的成长带来障碍。(4)亚硫酸盐还会促使细胞发生变异，诱导不饱和脂肪酸的氧化等危害。因此，食品中亚硫酸盐添加剂的含量必须经过严格地检验和控制。我国《食品添加剂使用卫生标准》(gb2760-2015)对各类食品中亚硫酸盐的允许用量有明确规定。即食品中亚硫酸盐使用量不得高于30mg/kg。

鉴于亚硫酸盐的这些严重副作用，迫切需要发展能够快速定量检测亚硫酸盐的检测方法。传统检测亚硫酸盐的方法主要有离子色谱法、电化学法和毛细管电泳法。由于这些方法需要复杂的前处理步骤、高端的仪器设备、耗时长，所以在食品检测应用中受到一定的限制。光化学传感器由于其具有价格低廉，方法简单、响应迅速和信息量大等优点近几年来迅速发展起来，受到广泛关注。其主要原理是利用传感器单元的光学性质(吸收或发射)改变作为输出信号，实现对待分析物的检测。光化学传感器按照其信号检测的不同，可以分为荧光化学传感器和比色化学传感器。荧光化学传感器(荧光探针)主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强，淬灭或者发光波长的变化；比色化学传感器则是借助于色调的变化，尤其是增色型比色传感通过肉眼观察就可检测，实际应用方便。现阶段单一的荧光化学传感器或比色化学传感器，由于其选择性好，灵敏度高，响应时间快等特点，目前在生物分子的检测中的应用越来越广泛。但能同时实现荧光传感和增色型比色传感的探针还很少，因此依照此性质制成便携式试剂盒显得十分必要。

通过分子的发光现象和吸收光谱的同时变化来探测分子间的相互作用的试剂盒，其优点可以概括为以下几个方面：(1)方便快捷，具有很高的灵敏度；(2)具有颜色和荧光双重响应，两种信号相互佐证，增加可信度；(3)如果在吸收光谱上有比较大的变化，可以在不借助于任何仪器的情况下，直接通过颜色的变化来达到检测的目的。

随着我国人民生活质量的提高，食品安全问题日益引起人们的高度重视。食品安全的保障依赖于可靠的质量监控，因此迫切需要研究出一种操作简单、检测快速且适于现场检测的试剂盒。试剂盒具有携带方便，操作简单，检测速度快等特点，应成为食品中亚硫酸盐现场快速检测的主流技术，是当前和今后一段时期内食品中亚硫酸盐快速检测的首选方法，为食品生产厂家的自我监控和市场监督提供有力的技术保障。

技术实现要素：

本发明的目的之一是克服现有技术中用于检测食品中亚硫酸盐的工具的性能和结构上的不足，提供一种新型的性能优良的原位实时检测工具，即亚硫酸盐反应试剂盒。

本发明的目的之二是针对亚硫酸盐提供一种新的具有复合信号响应的检测手段，即颜色和荧光双重响应，两种信号相互佐证，增加可信度的探针。

本发明的目的之三是提供一种新型探针化合物的合成途径。

本发明的检测食品中亚硫酸盐含量的荧光探针是具有以下结构的喹啉盐(即所述的荧光探针由一类喹啉盐构成)：

其中：r¹为具有强拉电子效应的芳香基团及其衍生物中的一种；r²为1～18个碳的烷基，芳基及其衍生物中的一种；+为正电荷。

本发明的检测食品中亚硫酸盐含量的制作过程为将适当浓度一定体积的探针a加到96孔板中适当保存。试剂盒中主要作用试剂(探针a)的合成方法：将带有取代基r¹的活泼甲基在催化剂作用下与喹啉醛缩合，在反应温度为25～120℃下反应0.5～60小时，将溶液浓缩后，利用硅胶柱层析得到中间产物b；中间产物b与三氟磺酸酯在反应温度为25～120℃下反应0.5～60小时，除去溶剂，利用硅胶柱层析得到探针a。其中，喹啉醛与带有取代基r¹的活泼甲基的摩尔比值为1～100。

其中：所述的体积为100-400μl，所述的浓度为1×10^-5摩尔/升。

所述的r¹为具有强拉电子效应的芳香基团及其衍生物中的一种；r²为1～18个碳的烷基，芳基及其衍生物中的一种；+为正电荷。

所述的催化剂是吡啶、六氢吡啶、三乙胺、碳酸钾中的一种。

所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲亚砜、乙腈、二氧六环、二氯甲烷、苯、甲苯所组成的组中的至少一种。

本发明的检测食品中亚硫酸盐含量的试剂盒能够用于食品安全中检测亚硫酸盐的浓度；根据试剂盒中探针的荧光和颜色两个特征判断食品中亚硫酸盐含量；其中：当所检测的食品中含有一定浓度亚硫酸钠时，试剂盒的荧光变化为从无荧光到较强的荧光，试剂盒的颜色变化为从浅色到深色；所述的较强荧光为蓝色、绿色、黄色、红色、近红外荧光中的一种；所述的深色为紫色、蓝色、绿色，红色中的一种。试剂盒中主要作用试剂(探针a)也可用于化学模拟生物体系中亚硫酸盐的检测，临床医学上血液、血清或者组织中亚硫酸盐的检测。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种以喹啉盐为母体，用于检测食品中亚硫酸盐的探针。该探针对亚硫酸根具有颜色加深和近红外荧光增强的双重可视化响应。分子结构简单，合成方法简便，且对亚硫酸盐有很好的选择性，食品中的其他添加剂(柠檬酸，甜蜜素，糖精钠，二丁基羟基甲苯，硝酸盐，酶抑制剂等)对检测没有干扰，该探针溶液的吸光度和荧光强度与亚硫酸盐的浓度在一定的浓度范围内(亚硫酸盐浓度范围：0～6×10^-6摩尔/升)均有良好线性关系，表现出良好的实际应用性。同时，本发明的检测食品中亚硫酸盐含量的试剂盒在使用时没有特殊的限制，在普通室温及其他温和条件下即可完成检测，简单快速，经济实用。本发明的试剂盒响应时间短，辨识度高，测定灵敏度高，制作过程简单，成本低廉，使得其极易实际推广应用。

附图说明

图1.本发明实施例2中的探针a的一维氢核磁谱图，横坐标为化学位移，纵坐标为信号强度。

图2.本发明实施例2中的探针对亚硫酸盐的选择性，横坐标为不同离子活性分子，纵坐标为吸光度。

图3.本发明实施例2中的探针对亚硫酸盐的选择性，横坐标为不同离子或活性分子，纵坐标为荧光强度。

图4.本发明实施例2中的探针的吸光度和亚硫酸盐浓度的线形关系，横坐标为亚硫酸盐的浓度，纵坐标为吸光度。

图5.本发明实施例2中的荧光探针的荧光强度和亚硫酸盐浓度的线形关系，横坐标为亚硫酸盐的浓度，纵坐标为荧光强度。

图6.本发明实施例2中的探针对食品(蔗糖和粉丝)中亚硫酸盐的检测效果图片。

具体实施方式

实施例1：

将二氰甲基苯并吡喃溶解在无水乙醇中，加入二氰甲基苯并吡喃1倍摩尔量的3-喹啉甲醛，加入两滴六氢吡啶，80℃回流反应5小时，冷却至室温，将溶液抽滤，收集析出的沉淀，将沉淀经过硅胶柱层析得到黄色固体化合物b。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.18(d,1h),8.97(dd,1h),8.38(s,1h),8.18(d,1h),7.94(d,1h),7.84–7.79(m,3h),7.67–7.62(m,2h),7.54–7.50(m,1h),7.11(d,1h),7.00(s,1h).¹³cnmr(125mhz,dmso-d6)δ158.03,153.43,152.58,150.18,148.31,136.07,135.82,135.71,131.16,129.35,129.16,128.74,127.95,126.77,125.25,122.09,119.57,117.64,117.41,116.11,115.45,107.84.

实施例2：

将化合物b和三氟甲基磺酸甲酯溶于干燥的二氯甲烷中，反应液在室温下搅拌一夜，反应完成后收集固体沉淀，沉淀用硅胶柱层析纯化得到红褐色固体探针a。附图1示出了探针a的一维氢核磁谱图。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.97(s,1h),9.54(s,1h),8.78(d,1h),8.55(d,1h),8.44(d,1h),8.32(t,1h),8.11(t,1h),8.02–7.96(m,2h),7.88–7.85(m,1h),7.80(d,1h),7.7(t,1h),7.07(s,1h),4.67(s,3h).¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ156.66,153.14,152.38,150.36,144.44,138.17,136.44,131.80,131.22,131.12,129.58,129.37,127.05,125.26,125.17,122.43,119.87,119.82,119.49,117.53,117.07,115.92,108.95,63.03,46.27.

实施例3：

请参见图2，图3。探针a对亚硫酸根的选择性。

使用实施例2中的探针a评价该探针对亚硫酸根的选择性。图2是化合物a(浓度为1.0×10^-5摩尔/升)在pbs缓冲溶液中(ph＝7.4)，当加入化合物10倍摩尔量的各种离子时溶液吸光度的变化。图3是化合物a(浓度为1.0×10^-5摩尔/升)在pbs缓冲溶液中(ph＝7.4)，当加入化合物10倍摩尔量的各种离子时溶液荧光强度的变化。荧光探针激发波长为582nm，发射波长为675nm。当在探针a溶液中加入的是探针1倍摩尔量的亚硫酸钠时，该荧光探针溶液的吸光度和荧光强度均增强约100倍。而加入10倍摩尔量的各种阴离子时，该探针溶液的吸光度和荧光强度几乎没有明显变化，说明该探针a对亚硫酸根有良好的选择性识别和实际应用性。

实施例4：

请参见图4，图5。探针a的吸光度和荧光强度和亚硫酸根浓度的线形关系。

使用实施例2中的探针a评价该探针的吸光度和荧光强度与亚硫酸根浓度的线形关系。图4,5是在吸收波长为510nm吸光度和发射波长为675nm的荧光强度随亚硫酸盐浓度的变化曲线，图4结果表明：探针a溶液(浓度为1.0×10^-5摩尔/升)的吸光度与亚硫酸根的浓度在0～6×10^-6范围内线形关系良好。图5结果表明：探针a溶液(浓度为1.0×10^-5摩尔/升)的荧光强度与亚硫酸盐的浓度在0～6×10^-6范围内线形关系良好，表现出良好的实际应用性。

实施例5：

请参见图6。探针a对食品(蔗糖和粉丝)中亚硫酸盐检测效果的图片。

使用实施例2中的探针a评价荧光探针食品(蔗糖和粉丝)中亚硫酸盐的检测。图6是在10μm探针a在水和二甲基亚砜的混合溶液(水和二甲基亚砜的体积比为2:3)中加入62.5mg/ml蔗糖和粉丝水溶液后荧光变化，结果表明：探针a能够检测出食品中的亚硫酸盐，显示出明显的颜色变化和近红外荧光变化，表现出良好的实际应用性。

需要进一步说明的是，本发明上述实施例仅仅是本发明中能够达到本发明目的的一类喹啉盐中的一种，正如本发明发明内容所述，本发明荧光探针是具有以下结构的喹啉盐：

其中：r¹为具有强拉电子效应的芳香基团及其衍生物中的一种；r²为1～18个碳的烷基，芳基及其衍生物中的一种；+为正电荷。

而对于本发明实施例中未述及的同类物，均与所述实施例实现相同的目的，并且达到相同的技术效果。