本发明涉及一种免疫学检测方法，具体涉及一种基于双功能纳米颗粒的免疫学检测方法。
背景技术：
：elisa是一种常用的检测方法，该方法灵敏度高、简便、成本低、易于操作，因而广泛应用于临床检测、食品安全检测、环境监测等诸多领域，成为免疫学检测领域中一种最为常用的检测方法。但是在某些需要高灵敏检测领域，elisa则难以施展拳脚。因而，提高elisa的灵敏性是免疫学检测方法研究的一个热点。比如，化学发光免疫学检测（chemiluminescentenzymeimmunoassay，cleia）、时间分辨荧光时间分辨荧光免疫检测（time-resolvedfluoroimmunoassay，trfia）是两种最为成功的高灵敏检测系统。这两种检测方法已经广泛应用于临床检测，展示出强大的生命力。随着科技的发展，纳米科技在生物医药领域的应用也越来越广泛。其中，纳米颗粒以其优良的理化属性在生物学在诊断领域得到广泛应用，但是现有采用纳米颗粒实现信号放大的检测方法的灵敏度还有待提高。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种基于双功能纳米颗粒的免疫学检测方法，其利用了纳米颗粒极大的比表面积，每个被夹心的抗原对应着更多的信号分子（酶、荧光基团等），因而可以大幅提高检测信号强度，进而提高检测的灵敏性。本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：一种基于双功能纳米颗粒的免疫学检测方法，该双功能纳米颗粒上包被有催化底物显色的酶或者信号分子，纳米颗粒上还有与检测抗体或者抗原发生特异性结合的分子。如上所述的免疫学检测方法中，所述免疫学检测方法为酶联免疫吸附试验、化学发光免疫检测分析、时间分辨免疫检测分析中的一种。如上所述的免疫学检测方法中，所述酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的一种。如上所述的免疫学检测方法中，所述双功能纳米颗粒上包被有辣根过氧化物酶和抗生物素抗体。如上所述的免疫学检测方法中，所述双功能纳米颗粒上包被有链霉亲和素和辣根过氧化物酶。如上所述的免疫学检测方法中，所述双功能纳米颗粒的粒径为10nm～100nm。如上所述的免疫学检测方法中，所述双功能纳米颗粒重悬于含有葡聚糖的重悬液中。进一步低，所述重悬液中的葡聚糖含量不小于5%。更进一步地，所述葡聚糖的分子量不大于10000。更进一步地，所述葡聚糖为α-葡聚糖或β-葡聚糖中的一种，或者两者的混合物。本发明具有如下有益效果：本发明利用了纳米颗粒极大的比表面积，每个被夹心的抗原对应着更多的信号分子（酶、荧光基团等），因而可以大幅提高检测信号强度，进而提高检测的灵敏性。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。实施例1检测艾滋病毒p24蛋白实验设计：取1份阴性血清样本和1份阳性血清样本，用阴性血清将上述两份样本梯度稀释，采用实验方法和对照方法检测梯度稀释的样本，比较两种方法检测灵敏性差异。a.实验方法：（1）双功能纳米颗粒的制备：按照frens法（1973）制备40nm胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入3μl0.2m碳酸钾的量调节ph；按照每毫升胶体金颗粒加入10μg辣根过氧化物酶（hrp），室温反应15min，然后按照每毫升胶体金颗粒加入8μg检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体），室温反应15min；加入牛血清白蛋白（bsa），使其终浓度为1%，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mmtris-hcl（ph=8.0）,0.5%tween20、0.4%酪蛋白、2%蔗糖)重悬颗粒。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（3）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（5）最后加入tmb（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）底物，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。b.对照方法：（1）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（2）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（3）用pbst将hrp标记检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释6000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μlhrp标记检测抗体稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（4）最后加入tmb底物，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。本实施例的实验结果如下：表1两种方法的灵敏性比较（od450）实验方法实验方法对照方法对照方法稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液2.5260.0780.7470.05821.7150.0680.4380.06840.9920.0730.2670.07880.5540.0740.1860.053160.3350.0580.1330.067320.2390.0710.0960.071实施例2粒径对于检测灵敏性的影响一种免疫学检测方法，其具体包括以下步骤：（1）采用不同粒径胶体金颗粒制备双功能纳米颗粒：按照frens法（1973）制备特定粒径的胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入3μl0.2m碳酸钾的量调节ph；按照每毫升胶体金颗粒加入10μg辣根过氧化物酶（hrp），室温反应15min，然后按照每毫升胶体金颗粒加入20μg检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体），室温反应15min；加入牛血清白蛋白（bsa），使其终浓度为1%，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mmtris-hcl（ph8.0）,0.5%tween20、0.4%酪蛋白、2%蔗糖)重悬颗粒。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（3）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（5）最后加入tmb底物，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。本实施例实验结果如表2所示。从表2可以看出，随着胶体金粒径的增加，检测信号强度先增强，后降低。到40nm时，检测信号达到最强。表2基于不同粒径胶体金的检测方法的灵敏性比较（od450）胶体金粒径样本od45010nm阳性血清0.78210nm阴性血清0.07020nm阳性血清0.84520nm阴性血清0.06840nm阳性血清1.02740nm阴性血清0.06560nm阳性血清0.90660nm阴性血清0.06380nm阳性血清0.81980nm阴性血清0.055100nm阳性血清0.479100nm阴性血清0.067实施例3间接法检测抗体实验设计：取1份阴性血清样本和1份阳性血清样本，用阴性血清将上述两份样本梯度稀释，采用实验方法和对照方法检测梯度稀释的样本，比较两种方法检测灵敏性差异。a.实验方法：（1）制备双功能纳米颗粒：按照frens法（1973）制备粒径40nm的胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入3μl0.2m碳酸钾的量调节ph；按照每毫升胶体金颗粒加入10μg辣根过氧化物酶（hrp），室温反应15min，然后按照每毫升胶体金颗粒加入20μg羊抗人igg，室温反应15min；加入牛血清白蛋白（bsa），使其终浓度为1%，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mmtris-hcl（ph8.0）,0.5%tween20、0.4%酪蛋白、2%蔗糖)重悬颗粒。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将布鲁氏菌bp26蛋白稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的布鲁氏菌bp26蛋白，置于4℃17h。（3）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有布鲁氏菌bp26蛋白的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入90μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl人血清样本，37℃孵育30min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（5）最后加入tmb底物溶液，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。b.对照方法：（1）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将布鲁氏菌bp26蛋白稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的布鲁氏菌bp26蛋白，置于4℃17h。（2）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有布鲁氏菌bp26蛋白的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入90μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl人血清样本，37℃孵育30min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（3）用pbst将hrp标记羊抗人igg稀释20000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μlhrp标记羊抗人igg稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（4）最后加入tmb底物溶液，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。本实施例实验结果如表3所示：可以看出实验方法较对照方法具有更高的灵敏性。表3两种方法的灵敏性比较（od450）实验方法实验方法对照方法对照方法稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液2.2990.0770.6820.05821.5650.0680.3990.07240.9230.0640.2430.07180.5040.0690.1690.068160.3550.0590.1210.069320.2570.0680.0870.062实施例4碱性磷酸酶检测体系检测实验设计：取1份阴性血清样本和1份阳性血清样本，用阴性血清将上述两份样本梯度稀释，采用实验方法和对照方法检测梯度稀释的样本，比较两种方法检测灵敏性差异。a.实验方法：（1）双功能纳米颗粒的制备：按照frens法（1973）制备粒径40nm的胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入5μl0.2m碳酸钾的量调节ph；按照每毫升胶体金颗粒加入8μg检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体），室温反应15min；然后按照每毫升胶体金颗粒加入10μg碱性磷酸酶（ap），室温反应15min；加入牛血清白蛋白（bsa），使其终浓度为1%，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mmtris-hcl（ph=8.0）,0.5%tween20、1%bsa、2%蔗糖)重悬颗粒。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（3）用tbs缓冲液（tbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；最后加入pnpp(对硝基苯磷酸二钠)底物溶液，置于37℃15min；加入100μl3mnaoh终止反应，用酶标仪在405nm处读取吸光度值，即od405值。b.对照方法：(1)包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。(2)用tbs缓冲液（tbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；(3)用pbst将ap标记检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释8000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μlap标记检测抗体稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；(4)最后加入pnpp（对硝基苯磷酸二钠）底物溶液，置于37℃15min；加入100μl3mnaoh终止反应，用酶标仪在405nm处读取吸光度值，即od405值。(5)本实施例实验结果如表4所示，实验方法较对照方法具有更好的信号强度。更好的检测灵敏性。表4两种方法的灵敏性比较（od405）实验方法实验方法对照方法对照方法稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液3.1070.0560.9190.06122.1090.0540.5390.05441.2200.0600.3280.05680.6810.0610.2290.065160.4120.0610.1640.062320.2940.0670.1180.067实施例5不同标记顺序对于检测信号的影响（hrp）实验方法1---具体见实施例1的a.实验方法。实验方法2（1）双功能纳米颗粒的制备：按照frens法（1973）制备粒径40nm的胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入7μl0.2m碳酸钾的量调节ph；按照每毫升胶体金颗粒加入8μg检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体），室温反应15min；按照每毫升胶体金颗粒加入10μg辣根过氧化物酶（hrp），然后，室温反应15min；加入牛血清白蛋白（bsa），使其终浓度为1%，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mmtris-hcl（ph8.0）,0.5%tween20、0.4%酪蛋白、2%蔗糖)重悬颗粒。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（3）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（5）最后加入tmb底物溶液，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。本实施例的实验结果如下：表5两种方法的灵敏性比较（od450）方法1方法1方法2方法2稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液1.8950.0690.5600.06421.2860.0610.3290.06140.7440.0750.2000.05980.4160.0660.1400.070160.2510.0640.1000.060320.1790.0630.0720.063实施例6采用稀土荧光纳米颗粒进行信号放大实验设计：取1份阴性血清样本和1份阳性血清样本，用阴性血清将上述两份样本梯度稀释，采用实验方法和对照方法检测梯度稀释的样本，比较两种方法检测灵敏性差异。a.实验方法：（1）双功能纳米颗粒的制备：取100μl浓度为10mg/ml的稀土荧光纳米颗粒（粒径：45nm）于900μlmes（吗啉乙磺酸）缓冲液（50mm，ph=6.1）中，涡旋混匀；加入20mgnhs（n-羟基琥珀酰亚胺）、20mgedc（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐），涡旋混匀；室温反应30min；10000rpm离心10min，弃上清；涡旋重悬颗粒；加入检测抗体（hivp24单克隆抗体）20μg、hrp20μg，室温反应2～4h；加入酪蛋白，使其终浓度为0.1%，继续反应2～4h；10000rpm离心10min，弃上清；用pbst洗涤颗粒三次；加入20ml颗粒重悬液（10mmtris-hcl，1%bsa，5%海藻糖）,重悬颗粒，备用。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（hivp24单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（3）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（5）最后加入tmb底物溶液，置于37℃15min；加入100μl2m硫酸终止反应，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。b.对照方法：同实施例1的b.对照方法本实施例的实验结果如表6所示，实验方法较对照方法具有更好的信号强度，更好的灵敏性。表6两种方法的灵敏性比较（od450）实验方法实验方法对照方法对照方法稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液3.6630.0651.0830.07422.4870.0690.6350.06941.4380.0760.3870.07380.8030.0770.270.077160.4860.0740.1930.067320.3470.0730.1390.063实施例7不同标记顺序对于检测结果的影响(ap)实验设计：取1份阴性血清样本和1份阳性血清样本，用阴性血清将上述两份样本梯度稀释，采用实验方法和对照方法检测梯度稀释的样本，比较两种方法检测灵敏性差异。实验方法1---具体见实施例4的a.实验方法。实验方法2（1）双功能纳米颗粒的制备：按照frens法（1973）制备粒径40nm的胶体金颗粒；按照每毫升胶体金颗粒加入4μl0.2m碳酸钾的量调节ph；按照每毫升胶体金颗粒加入10μg碱性磷酸酶（ap），室温反应15min；按照每毫升胶体金颗粒加入8μg检测抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体），室温反应15min；加入牛血清白蛋白（bsa），使其终浓度为1%，室温静置15min；10000rpm离心10min；弃掉上清，加入1/10胶体金体积的重悬液(10mmtris-hcl（ph8.0），0.5%tween20、1%bsa、2%蔗糖)重悬颗粒。（2）包被：用50mm碳酸盐缓冲液将包被抗体（艾滋病毒p24蛋白单克隆抗体）稀释至5μg/ml，酶标微孔板上每孔加入200μl稀释后的包被抗体，置于4℃17h。（3）用磷酸盐缓冲液（pbs，ph=7.4）洗涤步骤（2）包被有抗体的微孔板一次；再按300μl/孔加入封闭液（1%bsa），置于37℃2h；弃掉封闭液，加入100μl稀释液（5m尿素，1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚））、100μl血清，37℃孵育90min后用pbst（含0.05%tween20（聚乙氧基月桂酸清凉茶醇），ph=7.4，下同）洗涤5次；（4）用pbst将步骤1中所得双功能纳米颗粒稀释1000倍后，往步骤（3）制得的微孔板上每孔加入200μl双功能纳米颗粒稀释液，于37℃孵育30min后用pbst洗涤5次；（5）最后加入pnpp（对硝基苯磷酸二钠）底物溶液，置于37℃15min；加入100μl3mnaoh终止反应，用酶标仪在405nm处读取吸光度值，即od405值。本实施例的实验结果如表7所示，方法1的检测灵敏性明显要好于方法2的灵敏性。表7两种方法的灵敏性比较（od405）方法1方法1方法2方法2稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液2.9520.0530.8730.05822.0040.0510.5120.05141.1590.0570.3120.05380.6470.0580.2180.062160.3910.0580.1560.059320.2790.0640.1120.064实施例8重悬液中某些成分对于方法稳定性的影响实验设计：分别配制不同的配方的重悬液，重悬双功能纳米颗粒（实施例1、实施例4、实施例6），置于2～8℃不同时间，检测阴性样品和阳性样品各一份，平行检测三次，取平均值，比较不同重悬液对于方法稳定性的影响。重悬液配方具体如下：配方1：10mmtris-hcl（ph8.0）、0%葡聚糖、1%bsa、2%蔗糖、0.05%proclin300；配方2：10mmtris-hcl（ph8.0）、1%葡聚糖（mw1500）、1%bsa、0.05%proclin300；配方3：10mmtris-hcl（ph8.0）、3%葡聚糖（mw1500）、1%bsa、0.05%proclin300；配方4：10mmtris-hcl（ph8.0）、5%葡聚糖（mw1500）、1%bsa、0.05%proclin300；配方5：10mmtris-hcl（ph8.0）、7%葡聚糖（mw1500）、1%bsa、0.05%proclin300；配方6：10mmtris-hcl（ph8.0）、9%葡聚糖（mw1500）、1%bsa、0.05%proclin300；配方7：10mmtris-hcl（ph8.0）,0.5%tween20、1%bsa、2%蔗糖。本实施例实验结果如表8～10所示，从表8可以看出，在0天时，不管使用哪种重悬液，对于检测结果的影响均不大，彼此之间没有太大差异。但是在第28天时（表9），配方7的od值明显比第0天时降低。另外，随着重悬液中葡聚糖（mw1500）的浓度的增加，od值逐渐增大，当达到5%以上时，od值达到最高，且与第0天时的od值基本接近。说明葡聚糖能够提高双功能纳米颗粒的稳定性。第28天时（表10），配方7重悬的双功能纳米颗粒的检测od值进一步降低，同时，低浓度的葡聚糖配制的重悬液所重悬的双功能纳米颗粒的的检测od值也在继续降低，而5%以上的葡聚糖（mw1500）所配制的重悬液重悬的双功能纳米颗粒的检测od值与第0天、第28天的检测结果基本保持一致。再一次说明，在重悬液中添加5%以上的葡聚糖（mw1500）能够提高双功能纳米颗粒的稳定性。表8不同重悬液对于双功能纳米颗粒稳定性的影响（0天）表9不同重悬液对于双功能纳米颗粒稳定性的影响（28天）表10不同重悬液对于双功能纳米颗粒稳定性的影响（84天）实施例9不同分子量的葡聚糖对于稳定性的影响实验设计：分别用不同分子量（mw）的葡聚糖配制含有3%葡聚糖的重悬液，重悬双功能纳米颗粒（实施例1、实施例4、实施例6），置于2～8℃28天，检测阴性样品和阳性样品各一份，平行检测三次，取平均值，比较不同重悬液对于方法稳定性的影响。本实施例实验结果如表11所示，葡聚糖分子量为1500时，od值最高，随着葡聚糖分子量的增大，od值逐渐降低。表11不同分子量的葡聚糖对于双功能纳米颗粒稳定性的影响（28天）实施例10hrp和抗生物素抗体修饰的纳米颗粒检测hcv核心抗原取1份阴性血清样本和1份阳性血清样本，用阴性血清将上述两份样本梯度稀释，采用实验方法和对照方法检测梯度稀释的样本，比较两种方法检测灵敏性差异。a.实验方法：（1）双功能纳米颗粒的制备：按照frens法（1973）制备粒径40nm的胶体金颗粒；往1ml胶体金颗粒（40nm）中加入15μghrp，室温静置15min；加入25μl0.2m碳酸钾，涡旋混匀；加入23μg抗生物素抗体，涡旋混匀，室温放置15min；加入100μl10%bsa，室温放置15min；12,000rpm离心15min；用100μl重悬液重悬颗粒。（2）检测抗体的生物素化修饰：往1mghcv核心抗原的检测抗体中添加13.3μl新鲜配制的10mmnhs-lc-biotin溶液；室温静置30min；4℃，12,000rpm超滤，去除游离的生物素；用1×pbs（ph=7.4）洗涤3次；用1%bsa、50%甘油、pbs（ph=7.4）溶解生物素修饰的检测抗体，4℃保存。（3）微孔板的制备：取hcv核心抗原包被抗体，用20mmtris-hcl（ph7.5）包被液稀释至2.5μg/ml，200μl/孔包被corning牌elisa反应板，置于4℃18h；用pbs洗涤1次；加入300μl1%酪蛋白（ph7.4），37℃封闭2h；（4）每孔加入100μl样品处理液（0.3%tritonx-100，1.5%chaps，5%sds），再加入100μl血浆或血清样品，于37℃温育120min；（5）用pbst洗涤5次；（6）用含有0.1%酪蛋白的pbst将生物素修饰的hcv核心抗原的检测抗体稀释200倍后，往微孔板上每孔加入200μl上述稀释液，于37℃温育30min；（7）用pbst洗涤6次；（8）用含有0.1%酪蛋白的pbst将抗生物素抗体和hrp双分子标记胶体金颗粒稀释40倍后，往微孔板上每孔加入200μl上述稀释液，于37℃温育30min；（9）用pbst洗涤6次；（10）每孔加入200μl底物溶液，于37℃显色反应10min；（11）每孔加入100μl2m硫酸终止，用酶标仪在450nm处读取吸光度值，即od450值。b.对照方法在实验方法中，以羊抗兔igg-hrp（1:45,000稀释）替代a.实验方法中的抗生物素抗体和hrp双分子标记胶体金颗粒，其他反应试剂和步骤相同。本实施例实验结果如表12所示，可见，实验方法较对照方法具有更高的灵敏性。表12两种方法的灵敏性比较（od450）实验方法实验方法对照方法对照方法稀释倍数阳性血清阴性血清阳性血清阴性血清原液1.5890.0620.4090.07320.8930.0630.2510.07440.5670.0640.1490.05880.3320.0590.1270.062160.2270.0640.0820.072以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。当前第1页12