一种蛋白错配二硫键的分析方法与流程

本发明涉及蛋白检测领域，具体的涉及一种蛋白错配二硫键的分析方法。
背景技术：
：二硫键是蛋白和多肽中两个半胱氨酸残基侧链上的巯基通过氧化形成的“-s-s-”形式的共价键，蛋白通过各种链内和链间的二硫键连接在一起，它对蛋白维持正确的高级结构及正常的生物学功能发挥着至关重要的作用，是一种非常关键的翻译后修饰。错误的二硫键配对可能导致蛋白药物的活性降低，所以二硫键分析已成为目前蛋白药物结构表征分析中非常重要的检项。常用的蛋白药物二硫键的分析流程主要包括如下步骤：1)蛋白经变性剂变性处理后，在非还原的条件下将蛋白降解成肽段作为非还原肽段样品；2)取出部分非还原肽段样品经巯基还原试剂打开二硫键作为还原肽段样品；3)对非还原和还原肽段样品进行肽质量指纹图谱分析；4)在非还原肽段样品的质谱分析结果中寻找是否存在含理论配对二硫键的肽段，并在还原样品的质谱分析结果中进行提取，判断该肽段是否消失，以此来验证该肽段是否为含二硫键的肽段。该方法通常只关注正常配对的二硫键是否存在，而忽略了监测样品中的错配二硫键。现有技术中并没有专门用于监测蛋白药物样品中错配二硫键种类和含量的分析方法。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种蛋白药物错配二硫键的质谱分析方法，可用于监测蛋白药物中是否存在错误配对二硫键杂质组分，并对不同样品间错配二硫键的相对含量进行对比分析。本发明通过：1)制备含较高比例错配二硫键组分的鉴别组样品，通过分析该样品，对所有可能存在的错配二硫键肽段进行色谱定位和质谱鉴定；2)优化测试组样品的二硫键分析的酶切条件，尽量减少样品前处理过程中因样品处理引入的错配；3)采用优化后的样品处理方法制备测试组样品，并在测试组样品的分析结果中提取所有可能存在的错配二硫键肽段形式，通过这种方法鉴定样品中是否存在错配二硫键组分；4)选取质谱响应比较稳定的肽段作为内参肽段，并按如下公式计算各含错配二硫键肽段的相对含量，以此消除进样量不同造成的影响，并通过对比不同样品中各错配二硫键肽段的相对含量判断样品间错配二硫键组分是否存在差异。本发明提供的一个技术方案是：一种蛋白错配二硫键的分析方法，包括如下步骤：(1)将一部分蛋白待测样品采用变性试剂进行变性处理，同时加入巯基封闭试剂对自由巯基进行封闭，将样品的缓冲液置换为酶切缓冲液，然后用特异性蛋白酶进行过夜酶切，酶切结束后终止酶切，作为测试组样品；(2)将另一部分蛋白待测样品用变性试剂进行变性处理，蛋白变性后，在样品中加入巯基还原试剂，将样品的缓冲液置换为酶切缓冲液，然后用特异性蛋白酶进行酶切，以此作为鉴别组样品；(3)采用液相色谱串联质谱法对鉴别组样品和测试组样品进行肽质量指纹谱图分析。优选的，所述变性试剂是盐酸胍或尿素；所述变性试剂的终浓度为4～8m；所述变性处理条件为处理温度为37℃，处理时间为60min。优选的，所述巯基封闭试剂是n-乙基马来酰亚胺(nem)、碘乙酰胺(iam)或碘乙酸(iaa)等烷基化试剂；所述巯基封闭试剂浓度为1-50mm；所述封闭时的条件为处理温度为20～65℃，处理时间为5min～2h。优选的，所述特异性蛋白酶为lys-c蛋白酶、胰蛋白酶、glu-c蛋白酶、糜蛋白酶或者几种蛋白酶的组合。优选的，所述巯基还原试剂为二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)，所述巯基还原试剂的处理条件为20～65℃处理5min～2h。优选的，步骤(3)中所使用的液相色谱串联质谱为waters公司的esi-q-tof，关键质谱参数设定如下：采用正离子模式进行采集；毛细管电压：+2.5kv；锥孔电压：60v；离子源温度：120℃；去溶剂气温度：400℃；锥孔气流速：50l/h；去溶剂气流速：800l/h；所得数据采用unifi1.8工作站进行处理。优选的，所述换液步骤采用超滤离心或者脱盐柱的方式。优选的，所述终止酶切采用加入终浓度为1％的甲酸的方法。优选的，所述的酶切缓冲液为适合蛋白酶切的缓冲盐溶液，酶切缓冲液的ph根据酶以及目标蛋白种类的不同进行优化。优选的，所述步骤(3)的分析方法具体包括：采用质谱数据处理软件分析鉴别组样品的质谱数据，搜索鉴别组样品中存在的错配二硫键肽段，并获得其质荷比、保留时间及二级质谱等信息。然后在测试组的质谱数据中分别提取各错配二硫键肽段的质谱信号，通过提取离子流色谱图(xic)中相应保留时间处是否有目标峰出现判断测试组样品中是否含该错配二硫键。在测试组样品中选择一个质谱响应比较稳定的肽段作为参比肽段，通过错配二硫键肽段xic中目标峰的峰面积与参比肽段xic峰面积的比值，对各测试组样品中相应错配二硫键肽段的含量进行比较。本发明实施例中各肽段序列中“＝”代表两段肽段之间由二硫键链接。本发明的方法中鉴别组样品在制备过程中通过加入还原剂引入大量自由巯基，经超滤去除还原剂后巯基会自由配对形成错配二硫键，因此可以获得几乎所有可能的二硫键错配形式，酶切后会产生大量含错配二硫键的肽段，便于对这些肽段的鉴定，从而对各种可能的二硫键错配肽段进行色谱定位和质谱鉴定。本发明的方法具有如下的有益效果：该方法可以用于检测蛋白药物中的错配二硫键杂质组分，解决了现有二硫键分析方法中仅关注正确配对二硫键而忽视错误配对二硫键的不足，对于提高蛋白药物的结构表征分析水平、保障生物药物的安全性及有效性具有较大的实用价值。附图说明图1为贝伐单抗鉴别组样品的总离子流色谱图(tic)；图2为贝伐单抗鉴别组样品中错配二硫键肽段二级质谱示例图；图3为贝伐单抗鉴别组样品中错配二硫键肽段二级质谱示例图；图4为贝伐单抗鉴别组样品中错配二硫键肽段二级质谱示例图；图5为贝伐单抗测试组样品的tic图；图6为贝伐单抗测试组错配二硫键肽段的tic图示例；图7为贝伐单抗测试组错配二硫键肽段的tic图示例；图8为贝伐单抗测试组错配二硫键肽段的tic图示例；图9为雷莫芦单抗鉴别组样品的tic图；图10为雷莫芦单抗鉴别组样品中错配二硫键肽段二级质谱示例图；图11为雷莫芦单抗测试组样品的tic图；图12为雷莫芦单抗测试组中错配二硫键肽段的tic图示例；图13为peg-g-csf鉴别组样品的tic图；图14为peg-g-csf鉴别组样品中错配二硫键肽段二级质谱示例图；图15为peg-g-csf测试组样品的tic图；图16为peg-g-csf测试组中错配二硫键肽段的tic图示例。具体实施方式下面结合附图说明和以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。实施例1贝伐单抗(bevacizumab)错配二硫键分析本实施例是对贝伐单抗样品(浓度为25mg/ml)进行错配二硫键分析，方法步骤如下：1.1取20μl贝伐单抗样品，加入7.4m盐酸胍溶液92μl，使得盐酸胍的终浓度约为6.0m，于37℃孵育60min；1.2在上述样品中加入4.7μl浓度为50mm的dtt溶液，使得dtt的终浓度约为2.0mm，于37℃孵育30min；1.3采用3kdamilliporeamiconultra-0.5ml超滤管将溶液置换为100mmtris-hcl/1.0murea缓冲液(ph9.0)，并采用紫外分光光度计对蛋白浓度进行测定，用100mmtris-hcl/1.0murea缓冲液(ph9.0)将蛋白浓度稀释至0.2μg/μl；1.4取30μl上述蛋白样品，按照1:20(wt/wt)比例加入lys-c蛋白酶，于37℃酶切过夜；1.5酶切结束后，在上述样品中加入终浓度为1％甲酸终止酶切，采用12000rpm离心3min，将上清转移至进样瓶作为鉴别组样品；1.6另将待测贝伐单抗样品用色谱级纯水稀释至10mg/ml，取20μl稀释后的样品，加入2.2μl浓度为100mm的nem溶液，使得nem的终浓度约为10.0mm，于37℃孵育16min；1.7在上述样品中加入7.4m盐酸胍溶液92μl，使得盐酸胍的终浓度约为6.0m，于37℃孵育60min；1.8采用3kdamilliporeamiconultra-0.5ml超滤管将溶液置换为100mmtris-hcl缓冲液(ph7.5)，并采用紫外分光光度计对蛋白浓度进行测定，用100mmtris-hcl缓冲液(ph7.5)将蛋白浓度稀释至0.2μg/μl；1.9取30μl上述蛋白样品，加入3.3μlacn，并按照1:20(wt/wt)比例加入lys-c蛋白酶，于37℃酶切过夜；1.10酶切结束后，在上述样品中加入终浓度为1％甲酸终止酶切，采用12000rpm离心3min，将上清转移至进样瓶作为测试组样品；1.11对鉴别组样品和实验组样品进行rp-uplc-ms/ms肽质量指纹图谱分析，所采用的色谱条件和质谱条件分别如下：色谱条件：质谱条件：ms系统xevog2-xsqtof，waters离子化方式esipositive一级质谱扫描范围100-2000da二级质谱扫描范围100-2000da毛细管电压2.5kv锥孔电压60v离子源温度120℃去溶剂气温度400℃锥孔气流速50l/h去溶剂气流速800l/h1.12采用waters公司unifi1.8软件处理鉴别组中的正确和错配二硫键，确定该样品中所有可能形成的错配二硫键肽段的质荷比、保留时间等信息。各含二硫键肽段的具体信息如表1所示，鉴别组样品的总离子流色谱图见图1，错配二硫键肽段的一级和二级质谱示例图见图2-图4。1.13测试组样品质谱分析的tic示例图如图5所示，在测试组样品的质谱数据中提取表1中鉴定到的所有错配二硫键肽段离子，提取到的含错配二硫键肽段的xic示例图见图6-图8。当有多个测试组样品存在时，为了方便对测试组样品中各错配二硫键的含量进行比较，选取轻链d170styslsstltlsk183作为参比肽段，并计算各错配二硫键肽段的相对含量，测试组样品中检测到的错配二硫键肽段的xic目标峰的峰面积及相对含量如表2所示。实施例2：雷莫芦单抗(ramucirumab)错配二硫键分析本实施例是对雷莫芦单抗(浓度为25mg/ml)进行错配二硫键分析，方法步骤如下：2.1取20μl雷莫芦单抗样品，加入7.4m盐酸胍溶液92μl，使得盐酸胍的终浓度约为6.0m，于37℃孵育60min；2.2在上述样品中加入4.7μl浓度为50mm的dtt溶液，使得dtt的终浓度约为2.0mm，于37℃孵育30min；2.3采用3kdamilliporeamiconultra-0.5ml超滤管将溶液置换为100mmtris-hcl/1.0murea缓冲液(ph8.0)，并采用紫外分光光度计对蛋白浓度进行测定，用100mmtris-hcl/1.0murea缓冲液(ph8.0)将蛋白浓度稀释至0.2μg/μl；2.4取30μl上述蛋白样品，按照1:20(wt/wt)比例加入lys-c蛋白酶，于37℃酶切过夜；2.5酶切结束后，在上述样品中加入终浓度为1％甲酸终止酶切，采用12000rpm离心3min，将上清转移至进样瓶作为鉴别组样品；2.6另将待测雷莫芦单抗样品用色谱级纯水稀释至10mg/ml，取20μl稀释后的样品，加入2.2μl浓度为100mm的nem溶液，使得nem的终浓度约为10.0mm，于37℃孵育16min；2.7在上述样品中加入7.4m盐酸胍溶液92μl，使得盐酸胍的终浓度约为6.0m，于37℃孵育60min；2.8采用3kdamilliporeamiconultra-0.5ml超滤管将溶液置换为50mmnaac缓冲液(ph6.0)，并采用紫外分光光度计对蛋白浓度进行测定，用50mmnaac缓冲液(ph6.0)将蛋白浓度稀释至0.2μg/μl；2.9取30μl上述蛋白样品，加入3.3μlacn，并按照1:20(wt/wt)比例加入lys-c蛋白酶，于37℃酶切过夜；2.10酶切结束后，在上述样品中加入终浓度为1％甲酸终止酶切，采用12000rpm离心3min，将上清转移至进样瓶作为测试组样品；2.11对鉴别组样品和实验组样品进行rp-uplc-ms/ms肽质量指纹谱图分析，所采用的色谱条件和质谱条件分别如下：色谱条件：质谱条件：ms系统xevog2-xsqtof，waters离子化方式esipositive一级质谱扫描范围100-2000da二级质谱扫描范围100-2000da毛细管电压2.5kv锥孔电压60v离子源温度120℃去溶剂气温度400℃锥孔气流速50l/h去溶剂气流速800l/h2.12采用waters公司unifi1.8软件处理鉴别组中的正确和错配二硫键，确定该样品中所有可能形成的错配二硫键肽段的质荷比、保留时间等信息。各含二硫键肽段的具体信息如表3所示，鉴别组样品的总离子流色谱图见图9，错配二硫键肽段的一级和二级质谱示例图见图10。2.13测试组样品质谱分析的tic示例图如图11所示，在测试组样品的质谱数据中提取表3中鉴定到的所有错配二硫键肽段离子，提取到的含错配二硫键肽段的xic示例图见图12。为了方便对测试组样品中各错配二硫键的含量进行比较，选取轻链d170styslsstltlsk183作为参比肽段，并计算各错配二硫键肽段的相对含量，分析结果如表4所示。实施例3：聚乙二醇化重组人粒细胞刺激因子(peg-g-csf)错配二硫键分析本实施例是对peg-g-csf(浓度为10mg/ml)进行错配二硫键分析，方法步骤如下：3.1称取10mg尿素，加入16.7μlpeg-g-csf样品混匀，尿素终浓度约为6m的尿素，然后于37℃孵育60min；3.2在上述样品中加入2.8μl10mm的dtt涡旋混匀，使得dtt的终浓度约为1.0mm，然后于37℃孵育30min；3.3采用3kdamilliporeamiconultra-0.5ml超滤管将溶液置换为100mmtris-hcl，2mmcacl2/1.0murea缓冲液(ph8.0)，并采用紫外分光光度计对蛋白浓度进行测定，然后用100mmtris-hclcacl2/1.0murea缓冲液(ph8.0)将蛋白浓度稀释至1.0μg/μl；3.4取40μl上述蛋白样品，按照1:50(wt/wt)比例加入糜蛋白酶，于37℃酶切6h；3.5酶切结束后，在上述样品中加入终浓度为1％甲酸终止酶切，采用12000rpm离心3min，将上清转移至进样瓶作为鉴别组样品；3.6另取20μlpeg-g-csf待测样品，加入2.2μl100mm的nem溶液后涡旋混匀，使得nem的终浓度约为10.0mm，然后于37℃孵育16min；3.7称取10mg尿素，加入3.6中封闭后的peg-g-csf样品16.7μl，涡旋混匀，使尿素终浓度为6m，然后于37℃孵育60min；3.8采用3kdamilliporeamiconultra-0.5ml超滤管将溶液置换为100mmtris-hcl，2mmcacl2/1.0murea缓冲液(ph7.5)，并采用紫外分光光度计对蛋白浓度进行测定，用100mmtris-hcl，2mmcacl2/1.0murea缓冲液(ph7.5)稀释至至1.0μg/μl；3.9取40μl上述蛋白样品，并按照1:50(wt/wt)比例加入糜蛋白酶，于37℃酶切6h；3.10酶切结束后，在上述样品中加入终浓度为1％甲酸终止酶切，采用12000rpm离心3min，将上清转移至进样瓶作为测试组样品；3.11对鉴别组样品和实验组样品进行rp-uplc-ms/ms肽质量指纹谱图分析，所采用的色谱条件和质谱条件分别如下：色谱条件：质谱条件：ms系统xevog2-xsqtof，waters离子化方式esipositive一级质谱扫描范围100-2000da二级质谱扫描范围100-2000da毛细管电压2.5kv锥孔电压60v离子源温度120℃去溶剂气温度400℃锥孔气流速50l/h去溶剂气流速800l/h3.12采用waters公司unifi1.8软件处理鉴别组中的正确和错配二硫键，确定该样品中所有可能形成的错配二硫键肽段的质荷比、保留时间等信息。各含二硫键肽段的具体信息如表5所示，鉴别组样品的总离子流色谱图见图13，错配二硫键肽段的一级和二级质谱示例图见图14。3.13测试组样品质谱分析的tic示例图如图15所示，在测试组样品的质谱数据中提取表5中鉴定到的所有错配二硫键肽段离子，提取到的含错配二硫键肽段的xic示例图见图16。选取g5passlpqsf14作为参比肽段，并计算各错配二硫键肽段的相对含量，分析结果如表6所示。当前第1页1 2 3