一种检测血管内皮细胞中乙酰化PINK1的方法与流程

本发明涉及一种检测血管内皮细胞中乙酰化pink1的方法，具体涉及一种快速便捷的荧光免疫层析快速检测方法及乙酰化pinki蛋白半定量检测试纸。

背景技术：

我国今年来代谢性疾病发病率快速上升，该疾病往往是造成血管病变的主要元凶，如高脂血症、糖尿病及高尿酸血症等。研究表明2型糖尿病(t2dm)患者心血管疾病的风险，比非糖尿病患者要高2-4倍，而中年糖尿病人群中心血管疾病的发生率可高达44％,且糖尿病人群心血管疾病的死亡率达到了2.7％。脂肪组织作为一个新的内分泌器官已被重新认识，肥胖，尤其是中心性肥胖，堆积的内脏脂肪会分泌多种生物活性物质；另外，高胆固醇血症时，氧自由基过多形成氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)，这些有害物质对血管内皮细胞都具有毒性作用，是导致血管内皮功能障碍的重要因素。血管内皮损伤既是众多慢性疾病的结果，又是其它疾病的起始。糖尿病的一些慢性并发症均与内皮血管损伤有关，如糖尿病视网膜病变，神经病变，糖尿病肾病，糖尿病足等。已有研究表明血管内皮细胞受损并内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因子，即动脉粥样硬化是动脉壁对内皮细胞损伤的一种慢性炎症反应，反映血管内皮功能的相关因子，同样也能预测动脉粥样硬化的严重程度。血管内皮的修复也已成为治疗动脉粥样硬化的新靶点。

然而，目前还没有有效的方法早期检测血管内皮损伤。临床上目前用来检测血管内皮损伤的方法主要是颈动脉多普勒彩色超声波检查，此法虽能检测动脉内膜增厚及斑块形成，但此时内皮细胞的损伤已经是不可逆了。之前有以循环内皮细胞(cec)数量来衡量血管内皮的损伤程度，此法的缺点是不能准确反映内皮细胞的功能状态。这两种方法都不能准确地早期发现血管内皮损伤。本课题所建立的方法将克服这一不足，申请者将在循环内皮细胞中进一步观察检测细胞线粒体的功能状态，以确定内皮细胞损伤。

综上所述，通过循环内皮细胞线粒体功能状况的测定能确定内皮功能受损状况，对早期诊断具有重大意义。本项目通过仪器机械结构、电子技术、光路技术及软件研究，乙酰化pinki蛋白检测试剂制备技术研究和临床试验研究，掌握荧光免疫层析快速检测分析仪及半定量检测试纸条的关键制备技术和临床应用技术，开发出低成本快速便捷的荧光免疫层析快速检测仪器及乙酰化pinki蛋白半定量检测试纸条，满足我国临床对于心血管疾病早期预警的需求。

技术实现要素：

乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，它是在乙酰基转移酶的催化下，在蛋白质特定的位置添加乙酰基的过程，是细胞通过翻译后修饰控制基因表达、蛋白质活性和调节细胞内信号转导等生物活动的一种机制。乙酰化对磷酸化有调节作用。磷酸化也是一种重要的蛋白质翻译后修饰，pink1的磷酸化是启动pink1,p-ub,parkin通路的活性状态，pink1的磷酸化位点是ser228/ser402或thr257，而邻近激酶功能域(kinasedomain)中的lys347/lys369是潜在的乙酰化位点。

有研究报道pcaf可以介导il-6等在赖氨酸位点的乙酰化。本发明人在进一步的预实验中发现,在haec细胞，pcaf介导il-6乙酰化pink1，其结果是干扰了pink1的磷酸化并抑制线粒体自噬。同时还发现脂毒性物质ox-ldl对线粒体自噬也有抑制作用。il-6通过pcaf乙酰化pink1以干扰pink1磷酸化，进而抑制线粒体自噬,导致线粒体功能障碍。

研究发现，代谢性疾病早期出现代谢紊乱时就与线粒体功能障碍密切相关。有报道，2型糖尿病早期已经出现线粒体功能障碍，此时nad+依赖的去乙酰化酶(sirt1-7)及ppar增强因子1α(pgc-1α)活性下降，不能维持线粒体内稳定，其结果是线粒体内脂肪酸β氧化障碍，骨骼肌、脂肪组织和肝脏脂质蓄积，导致胰岛素抵抗和肥胖[14]。另外，氧化应激，tp53inp1功能丧失或pink1/parkin通路异常而至线粒体自噬缺损，都与胰岛素抵抗和肥胖的发生相关[15]。有研究表明，作为心血管疾病第三大主要原因的周围动脉疾病(pad)，其发生和发展与线粒体呼吸链状况密切相关[16]。那么代谢紊乱是如何损害血管内皮细胞线粒体自噬的，线粒体自噬损伤后是通过什么途径造成血管内皮功能障碍的，目前尚未完全阐明。这也是本研究所聚焦的关键问题所在。

线粒体是能量代谢的主要细胞器，脂肪酸，葡萄糖和氨基酸通过线粒体内三羧酸循环和内膜氧化磷酸化产生大量atp，同时，也产生活性氧(ros)和热量。因此，线粒体功能状况与机体的代谢，健康、疾病和寿命关系密切。一旦线粒体功能障碍，线粒体将无限制产生ros，这些ros将损害生物大分子，并出现能量供应障碍，进而影响多个生物过程。

自噬(autophagy)是细胞降解清除自身细胞质蛋白或细胞器的过程，藉此为细胞本身提供能量和实现某些细胞器的更新。是维持细胞内环境稳定的主要细胞生物学行为。线粒体自噬(mitophagy)是针对线粒体发生的细胞自噬，参与线粒体自噬的自噬相关蛋白(autophagy-relatedprotein,atg)除传统的lc3(agt8)和beclin1(atg6)外，酵母线粒体外膜上的atg32为诱导线粒体自噬所必须，在人类及哺乳类动物bcl2-l-13担当了atg32的功能[17,18]。

附图说明

图1.荧光免疫层析检测试纸条检测仪技术路线图

图2.pink1结构示意图。t257,s228和s402为磷酸化位点，l347和l369为乙酰化位点。

图3.pcaf介导il-6乙酰化pink1抑制pink1磷酸化。a.pcaf乙酰化pink1。b.il-6乙酰化pink1(l347/l369)。c.pcaf介导乙酰化pink1阻止pink1磷酸化。

图4.il-6和ox-ldl抑制haec细胞线粒体自噬。a:荧光标记慢病毒检测；b:慢病毒检测的统计分析，独立实验进行4次；c:电镜检测线粒体自噬，红色箭头为正常线粒体，绿色箭头为正常线粒体自噬，黄色箭头为损伤(肿胀)的线粒体，il-6和ox-ldl处理未见线粒体自噬；d：westernblot检测线粒体自噬相关蛋白。

图5.mtdna在血管内皮和haec细胞中的含量。rt-qpcra分析，a.糖尿病和高脂血症病人动脉内皮中的含量，b.db/db模型鼠主动脉内皮中的含量，c.il-6和ox-ldl处理的haec细胞mtdna的含量。*分别与对照组人群，野生型(wt)鼠对照组和haec细胞对照组相比，p<0.01.

图6.il-6和ox-ldl诱导haec细胞发生endomt。

图7.il-6和ox-ldl诱导haec细胞高表达α-sma和collageniv。a.免疫荧光分析ox-ldl诱导haec细胞高表达α-sma。b.westernblot分析il-6和ox-ldl诱导haec细胞高表达α-sma和collageniv。

具体实施方式

(1)乙酰化pink1损害线粒体自噬进而导致血管内皮功能损伤的研究

1)乙酰化pink1干扰pink1磷酸化进而损害线粒体自噬

收集结肠癌伴糖尿病和高脂血症患者肿瘤切除的癌旁肠系膜动脉组织，留取病人的血液标本，收集病史资料。建立高脂喂养加stz处理的糖尿病模型鼠和db/db糖尿病模型鼠，用免疫组化法、免疫荧光法、real-timepcr和westernblot法，检测糖尿病和高脂血症等代谢性疾病患者和2型糖尿病模型鼠血管内皮细胞pcaf的水平和mtdna拷贝数；在haec细胞中观察il-6和ox-ldl等炎性因子和脂毒性物质诱导pcaf的表达以及，观察在上述情况下pi3k/akt信号通路的活性状态。构建pcaf稳定表达载体，根据genebank数据库(cp022001.1)数据，设计pcaf,亚克隆入pbabe载体质粒，进而构建携带该质粒的腺病毒，并测序鉴定插入方向和序列正确。对pink1核苷酸序列进行定点突变，分别敲除pink1所有81个lys，结合chip方法确定影响pink1乙酰化位点是lys347和lys369，并排除其它lys位点乙酰化的可能。在haec细胞观察il-6和ox-ldl降低pink1的磷酸化水平；构建pink1lys347ala/lys369ala突变腺病毒并感染haec细胞，然后在此pink1突变hace细胞观察il-6和ox-ldl抑制pink1磷酸化的作用是否被阻断，以确定pink1lys347/lys369位点乙酰化将抑制pink1磷酸化；在haec细胞观察il-6和ox-ldl下调parkin水平并抑制其泛素化。在人和鼠原代动脉内皮细胞和haec细胞株中观察il-6和ox-ldl以及过表达pcaf诱导pink1乙酰化；应用乙酰化抑制剂漆树酸或pcafsirna敲低pcaf，然后观察il-6和ox-ldl乙酰化pink1的作用是否被阻。

2)低拷贝mtdna(线粒体自噬受损)损伤血管内皮功能

用rt-qpcr方法检测糖尿病和高脂血症等代谢性疾病患者和2型糖尿病模型鼠血管内皮细胞mtdna拷贝数；在haec细胞中观察il-6和ox-ldl下调mtdna拷贝数的状态。观察在上述情况下pi3k/akt信号通路的活性状态。同时观察乙酰化被抑制的情况下il-6和ox-ldl下调mtdna拷贝数改变的状况，用westernblot方法分别检测磷酸化和非磷酸化pi3k和akt的变化。用westernblot、rt-qpcr和免疫荧光激光共聚焦显微镜方法检测糖尿病和高脂血症患者和2型糖尿病鼠血管内皮e-cadherin、occludins、claudins和cytokoratin以及n-cadherin、fibronectin、vimentin、mmps和snail等endomt蛋白的表达状况以及α-sma和collagen等ecm表达水平及堆积状况。在haec细胞中观察il-6和ox-ldl诱导endomt发生和诱导ecm在细胞内异常堆积情况；分别阻断pi3k/akt等通路观察il-6和ox-ldl诱导endomt和并导致ecm细胞内异常堆积是否被阻断，以确定endomt和ecm堆积的信号转到通路。在il-6炎症模型鼠和高脂喂养糖尿病模型鼠观察动脉血管内皮功能状态，用westernblot检测ros，enos水平，用myograph血管舒张功能分析仪检测内皮依赖性血管舒张性，用tunel试剂盒检测内皮细胞的凋亡状态。建立α-sma基因敲除鼠(已由美国theuniversityoftexashealthsciencecenterathouston，diannamilewicz博士惠赠)，在pcaf基因敲除鼠和α-sma基因敲除鼠基础上制作il-6炎症炎症模型鼠和高脂喂养stz处理糖尿病模型鼠，观察血管内皮功能状态。用流式细胞仪检测原代培养细胞和haec细胞在il-6和ox-ldl处理后的细胞凋亡状况。

(2)确定循环内皮细胞乙酰化pink1为血管内皮损伤的特异性生物标记物的研究

1)分选提取cec并检测cec乙酰化pink1

收集内皮损伤(彩超确定斑块形成)病人以及apoe动脉粥样硬化模型鼠血液，利用流式细胞分选仪以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞，测量其产生的散射光和发射荧光的强度。经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。将分散有单细胞的液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。由于其在分选少量细胞时，流式细胞分选的精确度能有99％以上，且能同时进行多个标记，正选负选，因此可通过流式细胞分选技术来筛选标记了cd146+,cd45-抗体的外周循环血液中的内皮细胞并被进行定量分析。对cd146+,cd45-的循环内皮细胞进行双抗体免疫荧光染色激光共聚焦显微镜定性鉴定pink1乙酰化。分别以抗pink1和抗乙酰基(ach)孵育所分选提取的循环内皮细胞，用红色和绿色分别标记上述抗体，在激光共聚焦显微镜下显黄色的即为乙酰化pink1，由此鉴定cec细胞pink1乙酰化。

2)临床验证动脉内皮损伤(含斑块形成)病人循环内皮细胞pink1乙酰化

以颈动脉彩超作为临床诊断内膜损伤斑块形成的标准，收集伴或不伴颈动脉内膜增厚或斑块形成的2型糖尿病，高脂血症，高血压，高尿酸血症病人的血液标本，没有上述各类疾病的体检病人设为对照组。收集病史资料，每组为200例。各组病人的录入标准如下：

①2型糖尿病

t2dm诊断根据2010年美国糖尿病协会制定的糖尿病诊断标准：

a.糖化血红蛋白hba1c≥6.5％；或者

b.空腹血糖fpg≥7.0mmol/l；或者

c.口服糖耐量试验时2小时血糖≥11.1mmol/l；或者

d.在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者，随机血糖≥11.1mmol/l；

在无明确高血糖时，应通过重复检测来证实标准1～3。

②高尿酸血症(hua)

hua定义为正常嘌呤饮食下，非同日两次空腹血尿酸水平男性>420μlmol/l，女性>360μmol/l

③高血压

新指南高血压的诊断标准：

血压大于或等于130/80mmhg为高血压。剔除此前的标准：≥140/90mmhg；血压升高(elevatedbloodpressure)：收缩压120-129mmhg，舒张压小于80mmhg；

1级高血压：收缩压130-139mmhg，舒张压80-89mmhg

2级高血压：≥140/90mmhg。

④高血脂

关于高脂血症的诊断标准：目前国际和国内尚无统一的方法。既往认为血浆总胆固醇浓度>5.17mmol/l(200mg/dl)可定为高胆固醇血症，血浆三酰甘油浓度>2.3mmol/l(200mg/dl)为高三酰甘油血症。

⑤颈动脉内膜斑块

彩色多普勒超声诊断颈动脉内膜中层厚度(imt)。目前认为正常imt值应小于1.0mm，imt在1.0至1.5mm之间为内膜增厚，大于1.5mm或超过周边内中膜厚度的50％为斑块形成。

上述各组血液标本分选流式及双荧光激光共聚焦做定性分析。

(3)乙酰化pinki蛋白荧光免疫层析检测试纸条关键技术研究

1)超敏荧光微球制备工艺研究：优化单体加入量、第二乳化剂加入量、反应时间、荧光染料混合比例及混合量等工艺条件，制备单分散、稳定的200nm羧基化聚苯乙烯超敏荧光微球。

2)荧光纳米微球标记抗体工艺研究：优化荧光微球标记乙酰化pinki蛋白抗体的浓度、缓冲体系成分、标记温度、标记时间、封闭剂种类及用量等工艺条件，获得最佳工艺方案。

3)无纺布载体固定荧光纳米微球及释放工艺研究：通过优化乙酰化pinki蛋白抗体—荧光微球复合物稀释液配方如缓冲体系种类、ph、稳定性种类用量等条件，解决释放不完全而导致的背景信号高的问题。

4)荧光纳米微球在层析膜层析低残留工艺研究：荧光纳米微球抗体复合物流经层析膜过程中，会发生自身凝聚作用而滞留在膜前端，影响检测灵敏度或与高蛋白亲和力的层析膜结合，而滞留在膜中间，造成背景信号过高，影响检测灵敏度。我们通过优化不同的工艺配方，添加稳定剂，降低纳米微球自身凝聚反应，并添加封闭剂对层析膜进行流动封闭，降低层析膜对荧光纳米微球抗体复合物的吸附作用。

5)层析膜固定抗体稳定保存工艺研究：层析膜包被抗体后，容易在加样本检测时脱落，导致检测不准确和灵敏度低。我们通过优化包被缓冲液配方，提高抗体在层析膜上的固定牢固度，不通过优化包被后的层析膜的干燥处理工艺，提高抗体的热稳定性。

(4)荧光免疫层析快速检测分析仪关键技术研究

1)机械部分：

1)外壳及相关功能模块安装的设计及实验论证；

2)皮带传动机构的设计及实验论证；

3)导轨滑动机构的设计及实验论证。

2)光学部分：

a)特殊波长led的筛选技术研究及实验论证；

b)高稳定led光源的研究及实验论证；

c)点光源光路结构的设计及实验论证。

3)电子部分：

a)高灵敏、低漂移光电接收部分的电路设计及实验论证；

b)信号处理部分的电路设计及数据处理方式；

c)系统外围电路的设计及实验论证；

d)各执行机构驱动部分的设计及实验论证；

e)通讯系统的设计及实验论证。

4)软件控制部分：

1)低成本嵌入系统的设计及实验论证；

2)仪器自动打印及上传数据库的设计及实验论证；

3)定标数据的传递方式的设计及实验论证；

4)数据安全性(加密)的实现方法的设计及实验论证；

5)网络化软件系统框架的设计及实验论证。

5)仪器组装及调试

a)组织仪器安装及优化

b)组织模块调试、联机调试、整机测试

c)组织优化及验证，达成合格样机。

(5)临床研究

本项目临床研究是通过对开发的荧光免疫层析半定量检测试剂及配套的荧光免疫层析快速检测仪器通过对医院中的临床样本进行检测建立其参考值范围，并验证本项目产品的稳定性、科学性、适用性。主要研究内容如下：

1)参考范围的建立：用本项目研发出的乙酰化pinki蛋白荧光免疫层析半定量检测试剂及配套的仪器检测120位健康人群的血样，建立其参考值范围。

2)准确度实验研究；

3)精密度试验研究；

4)线性范围试验研究：包括试剂的线性范围试验研究及仪器的线性范围试验研究；

5)重复性试验研究：包括批内重复性研究及批间重复性研究。