一种用于防己药材、饮片及配方颗粒质量控制的薄层鉴别方法与流程

本发明涉及防己药材、饮片及配方颗粒质量控制的薄层鉴别方法。

背景技术

防己为防己科植物粉防己stephaniatetrandras.moore的干燥根，具有祛风止痛，利水消肿的功效，临床用于风湿痹痛，水肿脚气，小便不利，湿疹疮毒的治疗，疗效肯定。现代研究表明其中活性成分主要为粉防己碱(c38h42n2o6)和防己诺林碱(c37h40n2o6)。

为确保防己质量，需要对其进行质量控制。目前，《中国药典》2015年版一部防己项下对防己药材采用了薄层色谱鉴别，具体方法如下：

取本品粉末1g，加乙醇15ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加三氯甲烷制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5％浓氨试液(6：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

上述鉴别方法在实际工作中，由于鉴别斑点仅有两个，薄层色谱信息相对较少，专属性低，容易出现用对照品替代样品点样的假阳性结果，且防己中防己诺林碱的含量较低，薄层色谱条件进行鉴别时，斑点拖尾严重而分散，从而低于稀碘化铋钾的显色最低限度，造成防己样品薄层色谱中的防己诺林碱斑点观察不到，而出现假阴性结果，而展开剂中浓氨试液易挥发，展开剂饱和时间过短或过长均会产生严重边缘效应，影响防己药材的鉴别。

因此，需寻找一种用于鉴别防己药材、饮片及配方颗粒，专属特征更丰富，操作简便易行、专属性强、重复性好的方法。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于鉴别防己药材、饮片、配方颗粒中特征成分的检测方法。

本发明提供的检测方法，它是采用薄层色谱法检测，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加溶剂溶解，作为对照品溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材，加入溶剂提取，滤过，滤液蒸干，残渣加溶剂使溶解，作为对照药材溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己药材或防己饮片或防己配方颗粒粉末，加入5～15倍量乙醇，超声提取20～40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.25～2.5倍乙醇使溶解而得的溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，加入展开剂，饱和，加入薄层板，继续预饱和，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

优选该薄层色谱法检测的各步骤条件为：

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1～2mg的混合溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材，加入5～15倍量乙醇，超声提取20～40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.25～2.5倍乙醇使溶解而得的溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己药材或饮片或配方颗粒处理成细粉，取粉末，加4倍量乙醇，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.4倍量乙醇使溶解，作为供试品溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：所述的展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液，体积比为(5～7)∶(2～4)∶(0.5～1.5)∶(0.5～1.5)∶(0.1～0.3)。

进一步地，优选该薄层色谱法检测的各步骤条件为：

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材，加4倍量乙醇，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.4倍量乙醇使溶解而得的溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己药材或饮片或配方颗粒处理成细粉，取粉末，加4倍量乙醇，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加0.4倍量乙醇使溶解而得的溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：所述的展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液，体积比为6∶3∶1∶1∶0.2，饱和条件为温度4℃～35℃、相对湿度32％～75％的环境中饱和10分钟，加入薄层板后继续预饱和10分钟。

本发明薄层鉴别方法，可作为检测正品防己药材、饮片，控制防己配方颗粒中间体、成品质量的方法，具有很好的实用价值。本发明方法可准确检测判断防己药材、饮片是否为药典所载正品，同时也可准确判断防己配方颗粒生产的投料是否准确，评估颗粒中间体或成品所含防己特征成分的情况，以控制防己配方颗粒的质量，该方法专属特征更丰富，操作简便易行、重复性好、准确度高，可以避免现有检测方法存在的不足，具有良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1防己药材薄层色谱检测结果；

图2防己饮片薄层色谱检测结果；

图3防己配方颗粒薄层色谱检测结果；

图4展开系统ⅰ展开的薄层色谱图；

图5展开系统ⅱ展开的薄层色谱图；

图6展开系统ⅲ展开的薄层色谱图；

图7展开系统ⅳ展开的薄层色谱图；

图8采用天津思利达科技有限公司——可裁剪板展开的薄层色谱图；

图9采用上海恒奇仪器有限公司——默克板展开的薄层色谱图；

图10采用青岛海洋化工厂分厂——玻璃板展开的薄层色谱图；

图11为温度4℃环境中展开的薄层色谱图；

图12为温度35℃环境中展开的薄层色谱图；

图13为相对湿度32％的湿度环境中展开的薄层色谱图；

图14为相对湿度75％的湿度环境中展开的薄层色谱图；

图15专属性考察的薄层色谱图；

具体实施方式

实施例1本发明检测方法

1、检测方法

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材2g，加乙醇10ml，超声提取20min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己药材粉末2g，加乙醇10ml，超声提取20min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：按照《中国药典》2015年版第四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，加入甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液体积比为5∶2∶0.5∶0.5∶0.1展开，于温度4℃～35℃、相对湿度32％～75％的环境中饱和10分钟，放入薄层板，继续预饱和10分钟后，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，如图1所示。

实施例2本发明检测方法

1、检测方法

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇3ml使溶解，作为对照药材溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己饮片粉末5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇3ml使溶解，作为供试品溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：按照《中国药典》2015年版第四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，加入甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液[体积比为6∶3∶1∶1∶0.2展开，于温度4℃～35℃、相对湿度32％～75％的环境中饱和10分钟，放入薄层板，继续预饱和10分钟后，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，如图2所示。

实施例3本发明检测方法

1、检测方法

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己配方颗粒粉末5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：按照《中国药典》2015年版第四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，加入甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液体积比为6∶3∶1∶1∶0.2展开，于温度4℃～35℃、相对湿度32％～75％的环境中饱和10分钟，放入薄层板，继续预饱和10分钟后，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，如图3所示。

实施例4本发明检测方法

1、检测方法

(1)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材8g，加乙醇30ml，超声提取40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，作为对照药材溶液。

(3)供试品溶液的制备：取防己配方颗粒粉末8g，加乙醇30ml，超声提取40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，作为供试品溶液。

(4)薄层色谱鉴别方法：按照《中国药典》2015年版第四部通则0502薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，加入甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液体积比为7∶4∶1.5∶1.5∶0.3展开，于温度4℃～35℃、相对湿度32％～75％的环境中饱和10分钟，放入薄层板，继续预饱和10分钟后，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品、对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

实验例1本发明检测方法的展开系统考察

1.仪器、试药及实验材料

kq5200db型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；dk-98-ⅱ电热恒温水浴(天津市秦斯特仪器有限公司)、硅胶gf254薄层板(天津思利达科技有限公司，可裁剪板，批号：160122)，硅胶gf254薄层板(青岛海浪硅胶干燥剂有限公司，玻璃板，批号：20150502)，硅胶gf254薄层板(青岛海洋化工厂分厂，玻璃板，批号：20160611)，薄层色谱扫描仪(camag，madeinswitzerland)、自动点样仪(camag，madeinswitzerland)、防己对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121279-201502)、粉防己碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110711-201609，纯度99.2％)、防己诺林碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110793-201606，纯度98.8％)；甲醇、乙醇、甲苯、乙酸乙酯、异丙醇、丙酮、三氯甲烷、氨水等化学试剂均为分析纯。防己配方颗粒(批号：1803001，四川新绿色药业科技发展有限公司)

2.展开剂系统考察

(1)供试品溶液的制备：取本品粉末5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为混合对照品溶液。

(4)薄层色谱条件考察：吸取上述对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，分别用展开系统ⅰ、ⅱ、ⅲ。

展开系统ⅰ：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(体积比为6∶3∶1∶1∶0.2)

展开系统ⅱ：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(体积比为20∶10∶1∶1)

展开系统ⅲ：甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为2:4:2:1，10℃以下放置的上层溶液)

展开系统ⅳ：三氯甲烷-丙酮-甲醇-5％浓氨试液(体积比为6:1:1:0.1，《中国药典》2015年版防己项下薄层展开系统)

为展开剂，展开，置紫外光灯(254nm)下检视。

3、检测结果

如图4～7所示，展开系统ⅱ的薄层色谱图中所有成分斑点均在溶剂前沿，说明此系统不能充分鉴别防己药材中成分；展开系统ⅲ的薄层色谱图中斑点拖尾严重，防己诺林碱和粉防己碱对照品未充分展开，无法充分鉴别防己药材；展开系统ⅳ薄层色谱信息相对较少，专属性低，容易出现用对照品替代样品点样的假阳性结果；而展开系统ⅰ能将两种对照品充分分离，并且展开系统ⅰ相比展开系统ⅱ、ⅲ、ⅳ的薄层色谱信息更为丰富，系统所用试剂毒性较低，故选择展开系统ⅰ作为本品薄层鉴别的展开系统。

实验例2本发明检测方法的耐用性考察

1.仪器、试药及实验材料

与实验例1项下条件一致。

2.不同薄层板的考察方法及结果

选取三个不同厂家的硅胶gf254薄层板，分别取实验例1下对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μl，点于同一硅胶gf254薄层板上，按照实验例已选定的薄层色谱条件展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

如图8～10所示，在已选定的薄层色谱条件下，不同薄层板均能达到鉴别目的。

3.不同温度条件下展开的考察

在相对湿度固定为60％的条件下，分别改变薄层展开环境的温度，分别取实验例1下对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μl，点样，取点好样的薄层板，置4℃和35℃环境中展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

如图11～12所示，在4℃-35℃环境中展开的薄层色谱图各主斑点清晰，且分离度较好，均可达到鉴别目的，故该薄层鉴别方法在4℃～35℃耐用性良好。

4.不同湿度条件下展开的考察

如图13～14所示，在温度固定为25℃的条件下，分别改变薄层展开环境的相对湿度，分别取实验例1下对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各10μl，点样，取点好样的薄层板，分别置相对湿度为32％和75％的环境中展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。

结果表明，该薄层展开在相对湿度32％和75％环境中主斑点清晰，分离度好，故该法在相对湿度32％～75％环境中耐用性良好。

实验例3本发明检测方法的专属性考察

1.仪器、试药及实验材料

与实验例1项下条件一致。

2.实验方法

2.1样品溶液制备方法

(1)制备供试品溶液：取防己配方颗粒，研细，取粉末2g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取防己对照药材5g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；

(3)制备对照品溶液：取粉防己碱对照品、防己诺林碱对照品加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为混合对照品溶液。

(4)制备阴性样品溶液：按防己配方颗粒的制备工艺制备不含防己的成品，研细，取粉末2g，加乙醇20ml，超声提取30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为阴性样品溶液。

2.2薄层专属性实验

取步骤3中对照品溶液10μl，步骤2中对照药材溶液10μl，步骤1中供试品溶液和步骤4中阴性样品溶液各10μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以体积比6∶3∶1∶1∶0.2的甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液为展开剂，展开剂置于层析缸中，于温度25℃、相对湿度75％的环境中饱和10分钟，然后放入薄层板，继续预饱和10分钟后，展开，取出，晾干，在紫外光(254nm)下检视，观察阴性有无干扰。

3.实验结果

如图15所示，不含防己配方颗粒的供试品在防己诺林碱和粉防己碱对照品色谱斑点相应的位置上无干扰，表明该薄层鉴别方法的专属性良好。

综上，本发明薄层鉴别方法，可作为检测正品防己药材、饮片，控制防己配方颗粒中间体、成品质量的方法，具有很好的实用价值。本发明方法可准确检测判断防己药材、饮片是否为药典所载正品品种，同时也可准确判断防己配方颗粒生产的投料是否准确，评估颗粒中间体或成品所含特征成分情况，控制防己配方颗粒质量，该方法专属特征信息丰富，操作简便易行、成本低廉、重复性好的特点，具有良好的应用前景。