本发明属于化学分析领域，具体涉及一种紫草膏中紫草素的分离方法及利用高效液相色谱法检测从紫草护肤膏中分离出的紫草素含量的方法。
背景技术：
紫草为紫草科紫草属多年生草本植物，具有凉血活血、消炎止痛、解毒透疹之功，多用于血热毒盛、斑疹紫黑、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等症的治疗。紫草的主要药用成分为紫草素，具有愈伤、抗炎、抗菌、促进细胞再生、解毒透疹以及抑制肿瘤细胞生长等功效。紫草素为脂溶性成分，它不溶于水，易溶于乙醇、有机溶剂以及植物油脂。《中国药典》2010版(一部)采用紫外分光光度法测定左旋紫草素的含量，该方法操作繁琐，精密度不高。申请号为201710374145.1的中国专利文献公开了一种紫草素手性异构体的分离检测方法，采用高效液相色谱法及手性色谱柱，对左旋紫草素和右旋紫草素进行含量检测，但该方法仅适用紫草素标样的分析检测。实际紫草护肤膏中往往成分复杂，需要对样品进行前处理，通过萃取等方法将紫草素从紫草膏中分离，再采用高效液相色谱方法进行含量分析。申请号为201510266590.7的中国专利文献公开了一种紫草护肤中药组合物和紫草护肤膏及其制备方法，所述紫草护肤中药组合物的成分为：紫草30～70份、齿叶乳香15～45份、甘草5～15份、迷迭香叶1～10份，另外还添加玉米胚芽油、蜂蜡、可可籽酯、牛油果树果脂油、薰衣草精油、芒果籽酯、羊毛酯等成分，配方组分复杂。申请号为201510826929.4的中国专利文献公开了一种含野茶油的万用紫草膏，其主要原料按重量份数计为：野茶油15～40份、紫草20～45份、天然蜂蜡10～25份、甜杏仁油5～10份、小麦胚芽油1～3份、薰衣草精油0.5～2.0份、迷迭香精油0.5～2.0份、ve醋酸酯0.3～1.0份。申请号为201410412519.0、201610110642.6、201410191453.7、201510607282.6、201410216490.9、201610377530.7等中国专利文献均公开了紫草膏及其制备方法，这些紫草护肤膏以紫草素为主要原料，配以多种天然植物油、蜂蜡、凡士林、精油、植物提取物组合成。总体来说，市面上的紫草护肤膏品种繁多，但是大多并没有对功效成分紫草素进行含量测定，导致在产品质量及功效参差不齐。因此，在紫草素的实际应用研究中，如何从复杂多组分样品中简单、便捷地提取紫草素，并对其进行分离检测，这一环节对日化企业的产品质量控制尤为重要。本发明针对不同配方体系的紫草护肤膏，提供一种简单、便捷的紫草护肤膏中紫草素检测的样品前处理方法，并采用高效液相色谱仪检测紫草素的含量。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是填补紫草护肤膏中紫草素检测技术的空白，提供一种测定紫草膏中紫草素含量的前处理方法及高效液相色谱方法。本发明的前处理方法，简单、快速，解决了紫草膏中其它复杂成分对紫草素的干扰，提升了检测准确性及检测灵敏度。通过本发明的前处理方法以及高效液相色谱实现了紫草膏中紫草素的含量检测；本发明的方法具有重复性好、回收率高的特点。本发明解决的技术问题是采用以下技术方案予以实现：一种测定紫草膏中紫草素含量的前处理方法，包括以下步骤：(1)将包含紫草素的紫草护肤膏与有机溶剂混合，获得混合溶液；(2)采用碱水溶液对混合溶液进行提取，静置，取下层碱水溶液层，获得碱水溶液层；所述碱水溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；(3)向碱水溶液层中加入酸，调节溶液ph至4～6，加入有机溶剂进行萃取，静置，取下层有机层，去除有机层的有机溶剂，获得固体紫草素。步骤(1)中所述有机溶剂为石油醚、戊烷、正己烷、环己烷、异辛烷、乙酸乙酯中的一种以上。步骤(2)中所述碱水溶液的浓度为1wt％～10wt％；步骤(2)中所述提取的次数为3～5次，每次提取时，碱水溶液的加入量为混合溶液中有机溶剂体积的1～2倍，静置的时间为10～30min；提取完后，将碱水溶液层合并，获得碱水溶液层的提取液。步骤(3)中所述酸为盐酸，盐酸的浓度为5wt～10wt％。利用盐酸调节碱液ph为4～6，优选ph5。步骤(3)中所述有机溶剂为四氯化碳、二氯甲烷、氯仿、甲苯中的一种以上。步骤(3)中萃取的次数为3～5次，每次萃取时，有机溶剂的量为加入酸后溶液体积的0.3～2倍，静置的时间为10～30min；萃取完后，合并有机层，去除有机层的有机溶剂，获得紫草素。步骤(3)中所述去除有机溶剂是指将有机层进行减压旋转蒸发去除有机溶剂，减压旋转蒸发的条件为30～45℃，负压。基于所述样品前处理方法，本发明还提供一种液相色谱检测紫草护肤膏中紫草素的测定方法，以甲醇和磷酸水溶液为流动相，采用柱色谱分离技术，精确吸取待测样品液注入高效液相色谱仪进行色谱分离，采用紫外吸收检测器，于515nm波长处检测紫草素的吸收值，采用外标法，根据吸收峰面积计算其含量。所述测定紫草膏中紫草素含量的高效液相色谱方法，包括以下步骤：(a)将m0质量的包含紫草素的紫草护肤膏按照前处理方法进行处理，获得固体紫草素(粗品)；采用甲醇将固体紫草素配成溶液，获得待测样品，待测样品的体积为v；(b)利用紫草素标准样品(纯度≥98％)，配置一系列不同浓度的标准溶液，，通过高效液相色谱法测定，建立标准曲线，并制作线性回归方程；(c)采用高效液相色谱仪对待测样品中紫草素进行检测，获得色谱图；(d)利用紫草素标准曲线及线性回归方程，采用外标法，根据待测样品紫草素峰面积计算待测样品中紫草素含量即紫草素在待测样品中的浓度c；(e)包含紫草素的紫草护肤膏中紫草素含量计算：c：待测样品中紫草素的浓度，mg/ml；v：待测样品的体积，ml；m0：包含紫草素的紫草护肤膏的取样量，mg。步骤(a)中待测样品具体是指：采用甲醇溶解固体紫草素并定容，滤膜过滤，获得前处理液；再利用甲醇进行稀释，稀释至前处理液1～100倍，获得待测样品；步骤(b)中所述标准曲线建立：(b1)称取紫草素标准品，甲醇(色谱纯)溶解并定容，获得1mg/ml的紫草素标准溶液；(b2)采用系列稀释法，将1mg/ml的紫草素标准溶液稀释成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml的紫草素标准溶液，利用高效液相色谱进样检测，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，制作峰面积和紫草素浓度的线性回归方程。步骤(c)中所述检测的条件为：色谱柱：shimadzuinertsustainc18柱，5μm，250×4.6mm；流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液(体积比为75:25)；流速：0.6～1.0ml/min；柱温：25～35℃；检测波长：515nm；进样量：1～10μl。本发明的样品前处理方法，可以针对现有的不同配方体系的紫草护肤膏，以石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂对膏体状样品进行溶解；以naoh水溶液对样品进行紫草素提取后(取下层碱水层，紫草素与有机脂溶性成分分离)；利用盐酸水溶液调节溶液ph至弱酸性(紫草素析出，与水溶液成分分开)；利用二氯甲烷等有机溶剂提取水溶液中紫草素，通过减压蒸馏去除有机溶剂，得到纯度很高的紫草素。甲醇溶解，微滤膜过滤，利用高效液相色谱法检测紫草素的含量。本发明与现有技术相比，具有以下优点：(1)本发明从复杂多组分中分离出纯紫草素，分离方法简单、快捷，紫草素的纯度高；本发明的前处理方法从最大程度上将可能干扰检出结果的因素去除，进一步提升了液相色谱检测准确性及检测灵敏度。(2)本发明的前处理方法中，利用碱水溶液从石油醚等有机溶剂中分离水溶性及脂溶性成分，利用盐酸溶液调节溶液ph至4.0～6.0。溶液ph过低，紫草素会快速形成絮团状沉淀，大量水溶性活性成分被包裹在絮团状沉淀中，不利于分离干扰组分；而溶液ph过高，紫草素析出不完全，仍部分保留在溶剂中，导致最终提取率较低，测试结果比真实值低；而调节ph为4.0～6.0并优选为5.0时，紫草素形成细小沉淀，再利用二氯甲烷等有机溶剂从水溶液中提取出紫草素，使测试结果接近真实值。因此，本发明的前处理方法更接近真实值，检测效果更准确。(3)本发明所述紫草护肤膏中紫草素的检测方法的回收率达到95.0％～105％，相对标准偏差(rsds)均小于5％，具有重复性好、回收率高的特点，非常适用于紫草膏中紫草素的检测。附图说明图1为紫草素标准样品色谱图(0.04mg/ml紫草素标样)；图2为实施例1中紫草膏样品经过前处理并通过高效液相色谱法测试的色谱图；图3为浓度为0.01～0.10mg/ml的紫草素样品的标准曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特殊说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂原料。仪器：(1)高效液相色谱仪hplc(shimadzulc-20at)，配制：脱气泵、四元泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器；(2)超纯水系统(milliporereference)；(3)分析天平(赛多利斯bsa-224s)(4)台式ph计(梅特勒-托利多fe20k)(5)旋转真空蒸发器，配置：真空泵、水浴、低温循环系统(德国ika-rv10digital)(6)真空抽滤泵(巩义市予华仪器shz-dⅲ型)(7)超声波清洗器(声彦scq-6201c)(8)各种实验室通用玻璃器皿试剂：紫草素分析标准品，纯度≥98％(aladdin)hplc色谱纯：甲醇分析纯试剂：石油醚、戊烷、己烷、环己烷、异辛烷、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、甲苯、磷酸、盐酸、氢氧化钠；0.45μm有机和水相滤膜。下面提出了3款不同配方体系的紫草膏中紫草素的检测方法。实施例中所述紫草护肤膏为以天然植物油为主成分的紫草护肤膏、以凡士林主成分的紫草护肤膏或动物油脂主成分的紫草护肤膏。实施例1本实施例用于测定一款天然植物精华紫草膏中紫草素的含量。这款紫草膏主要成分为植物油脂与紫草提取物，配方如下表1所示。所述利用高效液相色谱法测定紫草膏中紫草素含量的前处理方法：(1)准确称量10g紫草膏样品，加入30ml正己烷溶剂溶解样品，得到粉红色溶液；(2)将溶液置于分液漏斗中，加入2wt％naoh溶液提取3次(在碱水中，紫草素与其它脂溶性成分分离，如：角鲨烷、油脂、ve等)，每次提取时氢氧化钠溶液的用量为30ml，静置25min，取下层水层(碱液层)；合并碱液层，加入10wt％hcl溶液，调溶液ph值至5.0，溶液呈粉色；再加入二氯甲烷萃取，萃取4次，每次萃取二氯甲烷的加入量为30ml，合并二氯甲烷层(取下层)；(3)将二氯甲烷层利用减压旋转蒸发仪浓缩，-0.1mpa负压，温度30℃，去除二氯甲烷，得到紫草素固体；(4)向紫草素固体中加入甲醇(色谱纯)溶解并定容至25ml容量瓶中，采用孔径为0.45μm滤膜过滤，即得用于检测紫草素的前处理溶液x-1号。前处理液x-1号用于后续高效液相色谱法的检测。表1一款天然植物精华紫草膏配方表实施例2本实施例用于测定一款天然小蜂蜜紫草膏中紫草素的含量。这款紫草膏主要成分为凡士林及紫草提取物，配方如下表2所示。所述利用高效液相色谱法测定紫草膏中紫草素含量的前处理方法：(1)准确称量10g紫草膏样品，加入20ml石油醚和20ml乙酸乙酯溶剂溶解样品，得到粉红色溶液；(2)将溶液置于分液漏斗，加入1.5wt％naoh溶液提取3次，每次提取时氢氧化钠溶液的用量为40ml，静置20min，取下层水层(碱液层)；合并碱液层，加入6wt％hcl溶液，调节溶液ph值至5.5，溶液呈粉色；再加入甲苯萃取，萃取4次，每次萃取时甲苯的加入量为40ml，合并甲苯层(取下层)；(3)将甲苯层利用减压旋转蒸发仪浓缩，-0.1mpa负压，温度35℃，去除甲苯，得到紫草素固体；(4)向紫草素固体中加入甲醇(色谱纯)溶解并定容至25ml容量瓶中，采用孔径为0.45μm滤膜过滤，即得用于检测紫草素的前处理溶液x-2号。前处理液x-2号用于后续高效液相色谱法的检测。表2一款天然小蜂蜜紫草膏配方表实施例3本实施例用于测定一款天然绵羊紫草膏中紫草素的含量。这款紫草膏主要成分为动物油脂及紫草提取物，配方如下表3所示。所述利用高效液相色谱法测定紫草膏中紫草素含量的前处理方法：(1)准确称量10g紫草膏样品，加入30ml石油醚溶剂溶解样品，得到粉红色溶液；(2)将溶液置于分液漏斗，加入1wt％naoh溶液提取3次，每次提取时氢氧化钠溶液的用量为30ml，静置30min，取下层水层(碱液层)；合并碱液层，加入5wt％hcl溶液，调节溶液ph值至5.2，溶液呈粉色；再加入氯仿萃取，萃取4次，每次萃取时氯仿的加入量为30ml，合并氯仿层(取下层)；(3)将氯仿层利用减压旋转蒸发仪浓缩，-0.1mpa负压，温度32℃，去除氯仿，得到紫草素固体；(4)向紫草素固体中加入甲醇(色谱纯)溶解并定容至25ml容量瓶中，采用孔径为0.45μm滤膜过滤，即得用于检测紫草素的前处理溶液x-3号。前处理液x-3号用于后续高效液相色谱法的检测。表3一款天然绵羊紫草膏的配方表原料名称百分比/％羊毛脂54.85蜂蜡10角鲨烷15新疆紫草(arnebiaeuchroma)提取物6蛇床子(cnidiummonnieri)提取物3马齿苋(portulacaoleracea)提取物3水解夏枯草(prunellavulgaris)提取物3余甘子(phyllanthusemblica)果提取物3薄荷醇1生育酚乙酸酯1红没药醇0.1丁羟甲苯0.05实施例1～3的前处理溶液(待测样品)x-1、x-2、x-3中紫草素含量的高效液相色谱检测方法如下：(1)配置标准溶液，建立标准曲线；称取100mg紫草素标准品(纯度≥98％)，精确至0.1mg，甲醇溶解后定容至100ml容量瓶，配成1mg/ml的紫草素标准溶液，充分振荡摇匀；将1mg/ml的紫草素标准溶液利用甲醇稀释，配制成浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml的紫草素标准溶液，利用高效液相色谱进样5μl检测；紫草素的出峰时间为9.1min，以紫草素标样的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线，线性回归方程为s＝1564880c-18300，相关系数r＝0.987；(2)将上述前处理获得的紫草膏前处理溶液x-1、x-2、x-3分别利用高效液相色谱hplc(shimadzulc-20at)进样5μl检测，获得谱图；(3)采用外标法和线性回归方程s＝1564880c-18300，根据待测样品(前处理液)中紫草素的峰面积s计算出紫草素含量c；(4)根据公式计算出紫草膏实际样品中紫草素的含量ω；公式中c：待测样品中紫草素的浓度，mg/ml；v：待测样品(即前处理液)的体积，ml；m0：实施例1～3中紫草护肤膏的取样量，mg。步骤(1)～(2)中所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：shimadzuinertsustainc18柱，5μm，250×4.6mm；流动相：甲醇-0.1％磷酸水溶液(体积比为75:25)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：515nm；进样量：5μl。紫草素标准样品(0.04mg/ml紫草素标样)的色谱图如图1所示；实施例1中紫草膏样品经过前处理并通过高效液相色谱法测试的色谱图如图2所示；浓度为0.01～0.1mg/ml的紫草素样品的标准曲线如图3所示。结果与分析本发明提供了三种不同配方紫草膏的三种不同的样品前处理方式。实施例1以正己烷作为溶剂，分别利用碱水、二氯甲烷提取紫草素；实施例2以石油醚和乙酸乙酯作为溶剂，分别利用碱水、甲苯提取紫草素；实施例3以石油醚作为溶剂，分别利用碱水、氯仿提取紫草素。利用高效液相色谱仪、紫草素标准曲线及线性回归方程计算得出紫草膏中紫草素的含量。实验结果显示，实施例1中一款天然植物精华紫草膏中紫草素含量为58.05ng/g；实施例2中一款天然小蜂蜜紫草膏中紫草素的含量为60.33ng/g；实施例3中一款天然绵羊紫草膏中紫草素的含量为53.12ng/g。实施例1～3均证明本发明的方法适用于不同的凡士林、植物油脂以及动物油脂配方制备的紫草膏样品，但不仅只适用于这些配方体系。实施例1～3中紫草提取物是一种混合物，除了包括紫草素，还包括其它活性成分。方法的验证1.最低检出限和最低定量限将一定量的紫草素的标准溶液加入到紫草膏样品中(例如实施例1中紫草膏)，使添加后紫草膏中紫草素的浓度分别为100、150、200、250ng/g按照本发明实施例1所述高效液相色谱检测紫草膏中紫草素的样品前处理方法和检测方法进行实验。根据信噪比s/n≥3为该物质的最低检出限，紫草膏中紫草素的检出限为10ng/g，根据信噪比s/n≥10为该物质的最低检出限，紫草膏中紫草素的检出限为30ng/g。2.精确度先后准确称量三份1g的紫草膏样品(实施例1)(精确至0.1mg)，并分别编号s-1、s-2、s-3，按照本发明实施例1所述方法对样品进行前处理与检测，对所述s-1、s-2、s-3紫草膏样品进行平行测定，分析结果见表4，平行样中紫草素的相对标准偏差为3.35％；进一步地，对第一个样品s-1进行重复测定5次，分析结果见表5，重复性测试的相对标准偏差为1.83％。表4样品的平行测试表5样品的重复性测试3.回收率将紫草素的标准溶液加入到空白紫草膏样品中，控制加标浓度分别为25、50、100ng/g(即获得紫草素已知浓度的样品)，按照本发明实施例1所述的高效液相色谱法检测紫草膏中紫草素的样品前处理方法和检测方法进行实验，每个加标浓度下进行6次平行测试，取平均值，根据实际加标量和检测结果，计算紫草膏样品的加标回收率，见表6，样品的加标回收率在95.0％～105.0％范围内。表6加标样品的平行测量加标量(ng/g)2550100实际测定平均值26.26±1.1247.59±4.15100.84±5.63回收率(％)105.0±4.4895.2±8.30100.8±5.63当前第1页12