一种微量样本的取样方法与流程

本发明涉及一种微量样本的取样方法，该方法尤其适用于化学、生物、医学检测和实验。

背景技术：

随着医疗模式的转变和个体化用药的不断发展，医学检验界迫切需要快速、精确的检测手段，分子检测则发挥出独特的优势。

目前，分子检测技术主要有核酸分子杂交、聚合酶链式反应（pcr）和生物芯片技术等。分子检测产品主要应用在肿瘤、感染、遗传、产前筛查等临床各科的检测，以及体检中心、技术服务中心、第三方检测机构及微生物快速检测市场等方面。

作为分子检测的重要技术手段，pcr能够定性和定量地检测目标核酸分子，在低丰度检测、稀有突变检测等日益增大的应用需求背景下，数字pcr作为一种核酸分子绝对定量技术，它将一个荧光定量pcr反应体系分配到大量微小的反应器中，在每个微反应器中包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板pcr扩增”，扩增结束后，通过对阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数，数字pcr无须依赖对照品和标准曲线就可进行精确地绝对定量检测。

当前，血常规、细胞学、病理学及免疫学等检验手段均朝着自动化、一体化、标准化的方向发展，但由于分子检测自身技术复杂性，从样品到结果的自动化实现过程中存在着诸多难以解决的技术问题。单就数字pcr检测仪的进样步骤而言，在本身样本输入量较少的情况下（10ul～20ul），现有技术多采用进样针插入样本中直接吸取的方式，显而易见，现有技术由于不能将吸样针插到管底（会撞针或堵针），从而不可避免地会造成一定程度的样本残留。

不仅如此，为使实验结果更加理想，要求生成的微滴在一定程度上保持大小均一，这间接要求推样时的样本流量尽可能平稳从而保证生成的微滴大小均一，完整的推样过程涉及流量建立、流量保持、流量降低至零等三个阶段，其中流量建立和流量降低至零是两个不可避免的流量波动阶段，这两个阶段所需时间越长对实验结果越不利，传统推样过程没有缓冲油辅助流量的建立与降低，而是直接推样，直接推样时样本首段和末段的接触介质分别是空气与管路驱动油，这两种介质粘度与样本相差很大，使样本流量的建立和降低耗时较长。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种改进的微量样本的取样方法，该方法能够在吸样时减少样本液体的残留。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种微量样本的取样方法，包括如下步骤：

a)提供样本容器，并在所述样本容器内设置样本液体和与所述样本液体不混溶或反应的第一隔离液体，其中使所述第一隔离液体处于比所述的样本液体更靠近所述样本容器底部的位置，所述第一隔离液体、所述样本液体之间形成第一液液相界面；

b)将取样管的取样端穿过所述的样本液体插入到所述的第一隔离液体中；

c)开始取样操作。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述步骤c)中，取样时，保持所述取样管的位置不变，先吸取部分所述第一隔离液体，然后将全部的所述样本液体吸入到所述取样管中。

优选地，所述样本容器为顶部开口的容器，所述样本容器内，所述第一隔离液体、所述样本液体自下而上依次设置。

在根据本发明的一个具体且优选实施方式中，所述的步骤a）中，还在所述样本容器内设置与所述样本液体不混溶或反应的第二隔离液体，所述第二隔离液体与所述样本液体之间形成第二液液相界面，所述的样本液体位于所述第一液液相界面、所述第二液液相界面之间。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述样本容器为顶部开口的容器，所述样本容器内，所述第一隔离液体、所述样本液体、所述第二隔离液体自下而上依次设置。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述步骤c)中，取样时，保持所述取样管的位置不变，先吸取部分所述第一隔离液体，然后将全部的所述样本液体吸入到所述取样管中，最后将部分所述第二隔离液体吸入到所述取样管中。

在根据本发明的一个优选实施方式中，所述步骤c）中，取样完毕后，所述取样管中的所述第一隔离液体与所述样本液体的体积比为0.1~0.9：1，优选为0.2~0.5：1，更优选0.2~0.4：1。

在根据本发明的又一优选实施方式中，所述步骤c）中，取样完毕后，所述取样管中的所述第二隔离液体与所述样本液体的体积比为0.1~0.9：1，优选为0.2~0.5：1，更优选0.2~0.4：1。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述步骤a)中，所述样本容器内的第一隔离液体与样本液体的体积比为0.1~1：1，优选0.3~0.8：1。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述步骤a)中，所述第二隔离液体与所述样本液体的体积比为0.1~1：1，优选为0.3~0.8：1。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述步骤b）中，所述取样管的取样端插入所述第一隔离液体的高度为所述第一隔离液体高度的1/4~3/4。

根据本发明，所述步骤a）中，所述样本容器内的样本液体可以为一层或多层，每层样本液体都相邻有隔离液体。

根据本发明，所述第一隔离液体、第二隔离液体没有特别限制。作为本发明的一种优选方案，第一隔离液体、第二隔离液体是油，尤其是与样本液体的粘度基本相同的油。

在一些具体的场合例如数字pcr检测领域，所述第一隔离液体、第二隔离液体分别包括但不限于氟碳油、硅油、矿物油、烃油、植物油等。

在根据本发明的一个具体实施方式中，所述第一隔离液体的密度大于所述样本液体的密度，所述样本液体的密度大于所述第二隔离液体的密度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明方法在取样管吸样时，取样管先吸取隔离液体，在重力作用下，样本液体随着隔离液体的减少而不断下降直至到取样管的取样端处，取样管继续吸取能够将样本液体全部吸入到取样管中，从而不必将取样管插到容器底的情况下也能有效减少或避免吸样残留，本发明方法尤其适于微量样本的取样。此外，采取该方法吸取的样本，在推送时可以稳定地推送出来，对于某些场合例如数字pcr液体检测领域，有助于获得大小均一的液滴。

附图说明

附图1为本发明实施例中取样管的取样端穿过第二隔离液体、样本液体插入到第一隔离液体中的图；

附图2为本发明实施例中吸样后取样管内的第一隔离液体-样本液体-第二隔离液体的夹心结构的液-液相液体的图；

1、取样管；11、取样端；2、样本液体；31、第一隔离液体；32、第二隔离液体；4、样本容器。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚明确的界定。

本发明提供了一种微量样本的取样方法，包括如下步骤：首先在样本容器中内设置样本液体和与所述样本液体不混溶或反应的第一隔离液体，其中使第一隔离液体处于比样本液体更靠近样本容器底部的位置，第一隔离液体、样本液体之间形成第一液液相界面；然后将取样管穿过样本液体插入到下部的隔离液体中，取样管的取样端与开口容器的下底面不接触，既能减少吸样管取样时吸样残留，又能避免取样管撞到开口容器的下表面造成取样管损坏的危险，取样管插入第一隔离液体稳定后，开始吸取液体。

根据本发明，样本容器有多种样式，可以是上端开口容器，侧面开口容器，上端、侧面同时开口的容器等，作为一种可选的实施方式，选用上端开口的容器作为样本容器；为了形成样本液体在第一隔离液体上面的液-液相液体，可使用加液装置将第一隔离液体先加入开口容器中，再在第一隔离液体上部加入样本液体，使得样本液体与开口容器的下表面隔开；若第一隔离液体的密度大于样本液体的密度，也可以利用加液装置同时或依次向所述样本容器中加入第一隔离液体和样本液体；为尽可能减少样本吸取残留，样本容器中的第一隔离液体与样本液体的体积比应控制在0.1～1：1，为避免资源浪费，优选的体积比为0.3～0.8：1。

根据本发明，为了使得样本液体与其他介质隔离，避免在吸取样本液体时吸入空气，还可以在样本容器中设置与样本液体不混溶或反应的第二隔离液体，第二隔离液体与样本液体之间形成第二液液相界面，在样本容器中，第一隔离液体、样本液体、第二隔离液体自下而上依次设置，形成夹心结构的液-液相液体，加液的方式不限，凡是能形成前述夹心结构即可。加液的方式具体例如可以是：先用加液装置在开口容器中加入第一隔离液体，然后在第一隔离液体上部加入样本液体，再在样本液体上部加入第二隔离液体，同样为尽可能减少样本吸取残留，在样本容器中，第一隔离液体与样本液体的体积比应控制在0.1～1：1，为避免资源浪费，优选的体积比为0.3～0.8：1，第二隔离液体与样本液体的体积比也应控制在0.1～1：1，优选为0.3～0.8：1。在开口容器中，样本液体还可以是多层，每层样本液体都相邻有隔离液体。

根据本发明，取样管取样时，优选避免取样管晃动和保持取样管的位置不变，以保证取样的精确性和稳定性，取样管先吸取部分第一隔离液体，样本液体不断下降直至到所述的取样管的，取样管继续吸取直至将全部的样本液体吸入到取样管中，若开口容器中的样本液体上面没有第二隔离液体，则取样结束，为保证在后续推样中样本液体流量稳定，取样管中的第一隔离液体与样本液体的体积比应控制在0.1～0.9：1，为达到更好地效果，优选为0.2～0.5：1，更优选0.2～0.4：1；若样本液体上面还有第二隔离液体，则继续吸取将部分所述第二隔离液体吸入到所述取样管中，同样为保证在后续推样中样本液体流量稳定，取样管中的第一隔离液体与样本液体的体积比控制在0.1～0.9：1，为达到更好地效果，优选为0.2～0.5：1，更优选0.2～0.4：1，第二隔离液体与样本液体的体积比也应控制在0.1～0.9：1，优选为0.2～0.5：1，更优选0.2～0.4：1。

根据本发明，为了保证取样管能够吸取适量的第一隔离液体，根据加入到样本容器中的样本液体和第一隔离液体的体积的不同，需要调整取样管的取样端在第一隔离液体中的高度位置，取样管的取样端插入第一隔离液体的高度一般为第一隔离液体高度的1/4～3/4。

根据本发明，第一隔离液体、第二隔离液体的具体选择与样本液体相关，至少满足：第一隔离液体、第二隔离液体不与样本液体发生反应、相融、萃取以及其它影响样本液体原有化学、物理性质，当同处于吸样管中，第一隔离液体与样本液体之间，第二隔离液体与样本液体之间分别可以形成稳定的液-液相界面。作为本发明的优选方案，当所吸取的样本液体用于加入到另外的一种液体中时，例如在制备数字pcr液滴的情形下，第一隔离液体、第二隔离液体优选是能够与该另外的一种液体混溶的液体，当混合第一隔离液体、第二隔离液体与该另外的液体后，可以形成均相体系。此外，还优选的，第一隔离液体、第二隔离液体具有与样本液体基本相同的粘度。优选地，当第一隔离液体、第二隔离液体、样本液体的粘度差的绝对值与样本液体的比值在20%以内即认为具有基本相同的粘度，基本相同的粘度保证了三种液体具有基本相同的流动性。此外，在某些场合例如液滴是数字pcr液滴时，第一隔离液体、第二隔离液体应能够不影响所生成的液滴的稳定性或干扰检测。通常，第一隔离液体、第二隔离液体可以选择与前述另外的一种液体相同或相类似。

根据本发明的一些实施方式中，第一、第二隔离液体可以分别是氟碳油、硅油、矿物油、烃油、植物油中的一种或多种组合。

根据本发明，对于第一、第二隔离液体，样本液体的相对密度大小没有特别限制，但作为优选，第一隔离液体的密度大于样本液体的密度，第二隔离液体的密度小于样本液体的密度，目的是为了降低液体重力的影响。

根据本发明，取样管可以连接具有吸取和推出液体驱动能力的液体驱动机构，作为一种可选的实施方式，液体驱动机构的推样速度范围是10纳升/分钟到10微升/分钟。

在本申请的一个优选实施方式中，取样管吸取第一隔离液体、样本液体和第二隔离液体后，可以利用液体驱动机构进行推样，在推样过程中，位于取样管首段的第二隔离液体先建立好流量并以恒定的流量值f输出，待第二隔离液体被推完后平稳的过度为样本液体流量，样本液体被推完后，液路系统保持原流量值f推动第一隔离液体，在此过程中由于利用隔离液体建立流量和结束流量，样本液体流量始终以恒定的流量值f输出。

根据本发明，为防止实验过程中温度波动对液体驱动精度的影响，在吸取第一隔离液体前，液体驱动机构和取样管中充满低膨胀系数的液体作为载流，作为一种可选的实施方式，载流的热膨胀系数范围可以为0.00001/摄氏度至0.0005/摄氏度。

根据本发明，为防止取样管液体在驱动过程中产生气泡，影响推样时的流量稳定性，优选对隔离液体进行真空脱气或者超声脱气处理。

根据本发明，为实现纳升级的液体吸取以及降低液体在取样管取样端的残留，对取样管管的取样端进行拉尖处理来降低取样端尖端的直径和横截面积；对取样管的内壁和取样端外壁进行疏水化处理，防止隔离液体、样本液体在其表面的吸附，作为一种可选的实施方式，取样管可选用毛细管。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明：

实施例1

附图1是取样管穿过样本液体插入到隔离液体中的吸样时的图，本实施例中，取样管1连接具有吸取和推出液体驱动能力的液体驱动机构（未示出），利用加液器（未示出）在样本容器4（选用200ul的离心管）中加入10ul的第一隔离液体31（3m氟化油hfe7500），再利用加液器在隔离液体32上加入20ul样本液体2（例如是包含待测核酸模板、缓冲水溶液、产物标记物质等的水相体系），再在样本液体2上加入10ul的第二隔离液体32（3m氟化油hfe7500），样本容器中的第一隔离液体31、样本液体2、第二隔离液体32的比例为1:2:1，将取样管1的取样端11插入到离心管4中的第一隔离液体31中，此实施例中取样端11位于沿第一隔离液体31的中间位置，随着第一隔离液体31不断被吸入取样管1中，样本液体2在不断下降，当取样管1吸取5ul的第一隔离液体31时，样本液体2下降到取样管1取样端11，取样管1开始吸取样本液体2，当取样管1吸取完20ul样本液体2，再吸取5ul的第二隔离液体32，完成液体吸取，此时，取样管1中的第一隔离液体31、样本液体2、第二隔离液体32的比例为1:4:1。如图2所示是吸样后取样管1内的第一隔离液体-样本液体-第二隔离液体的夹心结构的液-液相液体的图。吸样完成后，以2.7ul\min的流速推样，先将第二隔离液体32推出取样管1，建立起稳定的流量，待第二隔离液体32被推完后平稳的过度为样本液体2流量，样本液体2被推完后，液路系统保持原流量推动第一隔离液体31，从而使样本液体2流量在推出的时候始终保持平稳。

实施例2

本实施例提供的是生成多层夹心结构的液-液相液体。实施例2和实施例1相似，区别在于在本实施例的样本液体有多层，每层样本液体都相邻有隔离液体，具体步骤为，在实施例1的基础上，在容器中最上层的隔离液体上再加入样本液体，在加入的样本液体上继续加入隔离液体，形成多层夹心结构的液-液相液体，可以重复多次加样本液体和隔离液体的过程。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。