一种动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法与流程

本发明属于药物残留检测技术领域，具体涉及一种动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法。

背景技术

阿奇霉素(azithromycin，azm)是新一代大环内酯类抗生素，通过抑制蛋白质的合成起作用，临床上用于人上下呼吸道、泌尿道、皮肤及软组织感染和性传播疾病的预防和治疗。因其具有抗菌谱广、半衰期长、在酸性环境中稳定等特点而备受关注，我国地方兽药标准2004年曾收录该药,农业部则在2005年底将其列入禁用兽药名单。

阿奇霉素违规用于畜禽养殖，会影响畜禽疫病防治和畜禽产品安全、增加细菌产生耐药性的风险、威胁人类健康。虽然国家明令禁止，但养殖环节会带来经济效益受损，因此养殖户仍将抗生素添加于饲料中或通过其他途径使用，从而导致人用抗生素仍被滥用于畜禽，成为威胁畜禽产品安全的新隐患。

国内外学者已开展部分基质中阿奇霉素的检测技术研究，但是尚未颁布任何基质中有关阿奇霉素的检测标准。研究较多的检测方法有紫外检测法、荧光检测法和同位素内标法，但是采用紫外检测器的方法，吸收弱灵敏度极低；采用荧光检测器的方法，需要衍生，测定耗时；而采用同位素内标法，高效液相色谱-串联质谱法检测，方法快速、简便、专属性强，灵敏度高，是目前研究中比较推崇的一种检测方法。

目前，畜禽产品中阿奇霉素检测的基质主要是肌肉、肝脏、血液和粪便，而肌肉和肝脏需要宰杀活体动物取得，畜禽血液样品需要专业人员取得，而且在检测前需要冷链保存，防止变质；粪便易受污染，取样也不方便。此外，在休药期后，这些基质中的药物残留难于被检测出来。而毛发因为其结构成分特点和较低的代谢活性，使得药物进入后代谢缓慢，可长期蓄积保留，在畜禽毛发发中具有较长残留时间，而且毛发取样、运输方便，相比肌肉、肝脏、血液和粪便基质更适合作为检测样本为禽产品安全生产中违禁药物监管提供更可靠确证依据。目前尚未见畜禽毛发中阿奇霉素残留量检测方法。

技术实现要素：

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的畜禽产品中阿奇霉素检测结果不可靠，不利于畜禽产品安全监管，检测样品不易得或难于保存等缺陷，从而提供一种动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，包括以下步骤：

1.供试品溶液的制备

取毛发样品于二层医用纱布中，清洗，剪碎，与阿奇霉素-d3工作液混合，然后加入甲酸与甲醇混合溶液，室温超声30～60min，获得毛发提取液，过滤，吹干，乙酸缓冲液溶解残渣，聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)修饰fe3o4纳米材料磁固相萃取，氨化甲醇洗脱，吹干，用1ml甲醇水溶液(1:1,v/v)溶解残渣，过滤膜，作为供试品溶液；

2.高效液相色谱-串联质谱法检测

高效液相色谱条件：色谱柱：c18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相a为体积浓度为0.1％甲酸水溶液，流动相b为甲醇，流速：0.4ml/min；柱温：35℃；进样量：10μl；梯度洗脱程序：0～2min，2％b线性变化至40％b；2～3min，保持40％b，3～4min，40％b线性变化至75％b；4-5min，保持75％b，5～5.1min，75％b线性变化至98％b；5.1-6min，保持98％b；6-6.1min98％降为2％b；6.1～7.0min,维持2％b；

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：喷雾电压：3000v，离子源温度，150℃，鞘气温度：300℃；鞘气流量：12l/min。

优选的，所述甲酸与甲醇混合溶液中甲酸在甲醇中体积浓度为2～4％。

优选的，所述的甲醇与甲酸混合溶液中还含有过氧化氢，过氧化氢的体积分数为0.1％～0.5％。

优选的，所述的乙酸缓冲液的ph在4.0～5.0，浓度在0.1～0.2mol/l，以动物毛发的用量为基准，乙酸缓冲液的用量在15-40ml/g。

优选的，所述聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)修饰fe3o4纳米材料用量为20.0～100.0mg,制备方法为，将fecl3和feso4按2:1(摩尔比)溶解于水中，通入氮气保护20min～30min，按每毫摩尔加入0.05～0.2g聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)，加热到80℃，迅速加入氨水，继续搅拌30min～60min，用二次水和乙醇交替清洗，磁铁分离，所得纳米材料冷冻干燥备用。

优选的，所述氨化甲醇中氨水在甲醇中体积分数为2.0～5.0％，用量在2.0～5.0ml。

优选的，以动物毛发的用量为基准，所述甲醇与甲酸混合溶液的用量为40～60ml/g，所述阿奇霉素-d3工作液的用量为20～100μl/g，阿奇霉素-d3工作液的浓度为0.5～4.0mg/l。

优选的，所述质谱条件中阿奇霉素的定量离子为m/z749.5>591.4，定性离子为m/z749.5>158和阿奇霉素-d3的定量离子为m/z752.4>594.4。

本发明按照内标法以峰面积计算阿奇霉素在毛发中的残留量，计算公式为：

x--样品中阿奇霉素残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；

c--阿奇霉素标准工作液的浓度，单位为微克每升(μg/l)；

csi--标准工作溶液内标物阿奇霉素-d3的浓度，单位为微克每升(μg/l)；

ci--样品中溶液内标物阿奇霉素-d3的浓度，单位为微克每升(μg/l)；

as--阿奇霉素标准工作溶液的峰面积；

a--样品中阿奇霉素的峰面积；

asi--阿奇霉素标准工作溶液内标物阿奇霉素-d3的峰面积；、

ai--样品中阿奇霉素-d3的峰面积；

v--样品定容体积，单位为毫升(ml)；

m--样品称样量，单位为克(g)。

计算结果需要扣除空白值，结果少于0.3μg/kg时，视为未检出。

以上所述畜禽毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，所述方法在检测畜禽毛发中的应用，所述畜禽优选为鸡、猪、牛等畜禽类，最佳优选为鸡。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，以动物毛发为检测对象，无需宰杀鸡、猪、牛等畜禽，实现畜禽活体检测；毛发样品较肌肉、肝脏，粪便等获取方便，且由于毛发生长周期长，更能准确监控畜禽生长过程是否使用阿奇霉素，从而实现畜禽等食品安全生产监管目的，检测结果准确，不会出现假阳性、假阴性等情况，灵敏度高。

2.本发明提供的动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，通过选用特定比例甲酸和甲醇混合溶液，能够使得毛发样品在室温下进行水解，缩短药品前处理时间；此外，添加一定量的过氧化氢能更进一步的缩短水解时间，毛发样品水解提取条件温和，简便，省时。

3.本发明采用聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)修饰fe3o4纳米材料磁吸附阿奇霉素，吸附和净化效率高，能够明显降低基质效应，提高灵敏度，解决了毛发水解液难于离心和堵塞固相萃取小柱问题。

4.本发明提供的畜禽毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，该检测方法使用医用纱布包裹毛发清洗、过滤，极大节约了前处理时间，操作简便。此外，使用医用纱布避免了清洗过程中毛发损失，取样量最低可达到0.1g，对畜禽伤害少。

5.本发明提供的动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，采用“三级洗脱梯度”程序，通过对洗脱程序的调整以及样品水解条件等的选择，提高了该方法的检测灵敏度，检出限为0.3μg/kg。

附图说明

图1聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)修饰fe3o4纳米材料的扫描电子显微镜图；

图2阳性鸡毛样品及内标物多反应检测(mrm)色谱图；

图3阴性鸡毛样品及内标物多反应检测(mrm)色谱图；

图4阿奇霉素标准品及内标物多反应检测(mrm)色谱图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例

本发明提供的动物毛发中阿奇霉素残留量的检测方法，具体通过以下步骤实现：

1、聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)修饰fe3o4纳米材料的制备：

取2.70gfecl3·6h2o和1.39feso4·7h2o按2:1(摩尔比)溶解于200ml水中，通入氮气保护20min～30min，加入1.0g聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)，加热到80℃，迅速加入25.0ml氨水，继续搅拌30min，用二次水和乙醇交替清洗4次，磁铁分离，所得纳米材料冷冻干燥备用。

2、阿奇霉素线性回归方程与检测限

配置浓度为0.05μg/l～100.0μg/l的一系列阿奇霉素标准工作溶液，内标阿奇霉素-d3浓度为20.0μg/l，以峰面积比(y)对含量(x)作图，结果表明，在0.05μg/l～100.0μg/l范围内，峰面积比(y)与阿奇霉素浓度呈良好的线性关系。阿奇霉素的线性方程为y＝0.02356x+0.01484，相关系数r2＝0.9985。

在空白畜禽毛发样品中添加阿奇霉素标准溶液，按建立的方法进行检测，根据得到的阿奇霉素色谱峰的性噪比计算出方法的最低检测限(s/n＝3)为0.3μg/kg，定量限(s/n＝10)为1.0μg/kg。

3、回收率与精密度

以未检出阿奇霉素的空白畜禽毛发作为样品基质，在1.0μg/kg、5.0μg/kg、20.0μg/kg三个含量水平添加阿奇霉素标样，按前述试验方法测定并计算回收率，每个添加水平平行测定6次。试验测得阿奇霉素回收率在95.6％～103.2％范围，相对标准偏差在3.5％～4.6％，结果符合《gb27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》关于残留分析要求。阿奇霉素的测定方法回收率与相对标准偏差见表1。

表1畜禽毛发中阿奇霉素测定方法回收率与相对标准偏差(n＝6)

4、样品测定

取口服阿奇霉素分散片喂养得到的8份阳性鸡毛样品、4份未喂给阿奇霉素的鸡毛样品按照下面方法检测。

供试品溶液的制备：a.清洗：称取鸡毛样品0.5g，精确到0.1mg，置于二层医用纱布中，用15ml甲醇，15ml0.1％(v/v)甲酸水溶液，15ml二次水依次清洗，挤干；b.水解：取清洗好的鸡毛样品剪碎，置于50ml塑料离心管中，加入20.0μl1.0mg/l阿奇霉素-d3工作液和20.0ml3.0％(v/v)甲酸甲醇溶液(其中含有过氧化氢，其体积浓度为0.3％)，室温超声60min，获得鸡毛水解液；c.浓缩净化：鸡毛水解液用二层医用纱布过滤，在50℃氮吹近干，加入10.0ml0.1mol/lph5.0乙酸缓冲液溶解残渣，加入25.0mg聚二乙烯苯磺酸-乙烯基吡咯烷酮(mcx)修饰fe3o4纳米材料，磁吸附后，磁分离弃去乙酸缓冲液。用2.0ml5％氨化甲醇洗脱纳米材料，在50℃氮吹近干，用1.0ml甲醇+水(1+1,v/v)溶解残渣，过0.22μm滤膜，作为供试品溶液。

高效液相色谱-串联质谱法检测：

液相色谱条件：色谱柱：agilenteclipseplusc18，2.1mm×100mm,1.8μm；流动相a为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为甲醇，流速：0.4ml/min；柱温：35℃；进样量：10.0μl；梯度洗脱程序：：0-2min，2％b线性变化至40％b；2～3min，保持40％b，3～4min，40％b线性变化至75％b；4-5min，保持75％b，5～5.1min，75％b线性变化至98％b；5.1-6min，保持98％b；6-6.1min98％降为2％b；6.1～7.0min,维持2％b。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：喷雾电压：3000v，离子源温度，150℃，鞘气温度：300℃；鞘气流量：12l/min。阿奇霉素的定量离子为m/z749.5>591.4，定性离子为m/z749.5>158和阿奇霉素-d3的定量离子为m/z752.4>594.4。

检出上述样品中含有阿奇霉素残留量在6.5μg/kg～258.6μg/kg之间，未喂养阿奇霉素的鸡毛样品未检出阿奇霉素残留，部分色谱图见图2-4，说明该检测方法具有可行性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。