一种畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法与流程

本发明属于药物残留量检测
技术领域：
，具体涉及一种畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法。
背景技术：
氧氟沙星为第三代喹诺酮类抗菌药，具有较好的抗菌作用。经农业部组织开展的兽药安全性评价认为，氧氟沙星原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险。长期食用氧氟沙星药品残留肉食品可造成人体呼吸道感染、基因突变、致癌。根据《兽药管理条例》第六十九条规定，农业部第2292号公告决定在食品动物中停止使用氧氟沙星等4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号。目前，畜禽产品中氧氟沙星检测的样本主要是肌肉、肝脏、血液和粪便。肌肉和肝脏需要宰杀活体动物取得。畜禽血液样品需要专业人员取得，而且在检测前需要冷链保存，防止变质。粪便易受污染，取样也不方便。此外，在休药期后，这些样本中残留的氧氟沙星难于被检测出来。与肌肉、肝脏、血液和粪便相比，毛发因其结构成分特点和较低的代谢活性，使得药物进入后代谢缓慢，具有较长残留时间，同时毛发取样、运输方便，更适合作为检测样本，为畜禽产品安全生产中违禁药物监管提供更可靠确证依据。此外，毛发在医用纱布的清洗过程中操作方便、不会损失，仅需少量毛发就可分析，可实现对畜禽养殖过程中违禁药物的全程监控。目前尚未见畜禽毛发中氧氟沙星残留量检测方法。技术实现要素：因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中氧氟沙星检测样本易变质、被污染，难保存，取样不方便等问题，从而提供一种检测氧氟沙星残留量的方法。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备清洗：取畜禽毛发样品置于医用纱布中，清洗，烘干；水解：将上述样品剪碎，加入氧氟沙星-d3标准工作液和甲酸甲醇混合液，室温超声，获得样品水解液；净化：水解液过滤后加入正己烷，振荡，离心，取下层水解液，在40-50℃氮吹近干，加入甲醇水溶液溶解残渣，过滤后得到供试品溶液；(2)高效液相色谱-串联质谱法检测液相色谱条件：色谱柱：c18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相a为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为甲醇，流速：0.4ml/min；柱温：35℃；进样量：10.0μl；梯度洗脱程序：0-2min，2％b线性变化至30％b；2-4min，保持30％b；4-4.1min，30％b线性变化至60％b；4.1-6min，保持60％b；6-6.1min，60％b线性变化至98％b；6.1-7min，保持98％b；7-7.1min98％b降为2％b；7.1-8.0min，维持2％b；质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：喷雾电压：3000v，离子源温度，150℃，鞘气温度：300℃；鞘气流量：12l/min。优选的，以畜禽毛发用量为基准，所述标准工作液用量为100-250μl/g。优选的，所述标准工作液浓度为0.2-1.0mg/l。优选的，所述甲酸的体积分数为2％-4％。优选的，所述甲酸甲醇混合液还包括过氧化氢；更优选的，过氧化氢占甲酸甲醇混合液总体积的0.5％-2％。优选的，以畜禽毛发用量为基准，所述甲酸甲醇混合液的总用量为50-100ml/g。优选的，所述超声时间为40-60min。优选的，以畜禽毛发用量为基准，所述正己烷用量为40-60ml/g。优选的，以畜禽毛发用量为基准，所述甲醇水溶液的用量为2-10ml/g；更优选的，甲醇与水的体积比为(0.5-2.5):1。优选的，所述质谱条件氧氟沙星的定量离子为m/z362>318.1，定性离子为m/z362>261.1和氧氟沙星-d3的定量离子为m/z365.1>321.1。本发明提供的畜禽毛发中检测氧氟沙星残留量的方法，该方法按照内标法以峰面积计算氧氟沙星在毛发中的残留量，计算公式为：x--样品中氧氟沙星残留量，单位为微克每千克(μg/kg)；c--氧氟沙星标准工作液的浓度，单位为微克每升(μg/l)；csi--标准工作溶液内标物氧氟沙星-d3的浓度，单位为微克每升(μg/l)；ci--样品中溶液内标物氧氟沙星-d3的浓度，单位为微克每升(μg/l)；as--氧氟沙星标准工作溶液的峰面积；a--样品中氧氟沙星的峰面积；asi--氧氟沙星标准工作溶液内标物氧氟沙星-d3的峰面积；ai--样品中氧氟沙星-d3的峰面积；v--样品定容体积，单位为毫升(ml)；m--样品称样量，单位为克(g)。计算结果需要扣除空白值，结果少于0.2μg/kg时，视为未检出。本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明提供的畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法。该检测方法以畜禽毛发为检测对象，无需宰杀鸡、猪、牛等畜禽，实现了畜禽活体检测；与肌肉、肝脏、粪便等样品相比，畜禽毛发作为样品克服了易变质、易被污染，难保存，取样不方便等问题；由于毛发生长周期长，更能够准确监控畜禽生长过程中是否使用氧氟沙星，从而实现对畜禽等食品安全生产监管目的；并且该检测方法操作简便，结果准确，不会出现假阳性、假阴性等情况发生，灵敏度高。2.本发明提供的畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法。该检测方法通过选用特定比例甲酸甲醇混合液，能够使畜禽毛发样品在室温下水解，缩短样品制备时间；此外，添加过氧化氢能更进一步降解毛发，释放氧氟沙星，提高提取效率。3.本发明提供的畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法。该检测方法使用医用纱布包裹毛发清洗、过滤，极大节约了前处理时间，操作简便；此外，使用医用纱布避免了清洗过程中毛发损失，取样量最低可达到0.1g，对畜禽伤害少。4.本发明提供的畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法，通过对样品制备条件的选择和色谱洗脱梯度调整，最低检测限可以降低至0.2μg/kg。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1阳性畜禽毛发样品及内标物多反应检测(mrm)色谱图；图2阴性畜禽毛发样品及内标物多反应检测(mrm)色谱图；图3氧氟沙星标准品及内标物多反应检测(mrm)色谱图。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。实施例1.标准溶液的配制标准溶液的配制：准确称取适量的氧氟沙星和氧氟沙星-d3标准品，用甲醇溶解配制成100.0-1000.0mg/l标准溶液。标准储备溶液配制：移取适量的标准溶液至10.0ml容量瓶，用甲醇稀释至刻度，配制1.0mg/l标准储备溶液。标准工作溶液配制：将标准储备溶液，用甲醇-水溶液(1:1)适当稀释。2.线性回归方程与检测限配制浓度为0.05μg/l-100.0μg/l的系列氧氟沙星标准工作溶液，内标氧氟沙星-d3浓度为50.0μg/l，以峰面积比(y)对含量(x)作图，结果表明，在0.05μg/l-100.0μg/l范围内，峰面积比(y)与氧氟沙星浓度呈良好的线性关系。氧氟沙星的线性方程为y＝0.02962x+0.0007552，相关系数r2＝0.999。在鸡毛样品中添加氧氟沙星标准溶液，使样品中氧氟沙星浓度为1.0μg/l，按建立的方法进行检测，根据得到的氧氟沙星色谱峰的性噪比计算出方法的最低检测限(s/n＝3)为0.2μg/kg，定量限(s/n＝10)为0.5μg/kg。3.回收率与精密度取空白鸡毛作为样品，在1.0μg/kg、5.0μg/kg、25.0μg/kg3个含量水平添加氧氟沙星标样，按上述实验方法处理和测定，每个添加水平平行测定6次。实验测得氧氟沙星回收率在94.3％-103.2％范围，相对标准偏差在3.3％-4.5％，结果符合《gb27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》关于残留分析要求。氧氟沙星的测定方法回收率与相对标准偏差见表1。表1畜禽毛发中氧氟沙星测定方法回收率与相对标准偏差(n＝6)添加量(μg/kg)平均回收率(％)相对标准偏差(％)1.0101.23.35.0103.24.525.094.33.84.样品测定本发明提供的一种畜禽毛发中氧氟沙星残留量的检测方法，包括以下步骤：取口服氧氟沙星胶囊给药喂养得到的6份阳性鸡毛样品、5份未喂给氧氟沙星的鸡毛样品。(1)供试品溶液的制备a.清洗：称取鸡毛样品0.2g，精确到0.1mg，置于二层医用纱布中，用15ml甲醇，15ml0.1％(v/v)甲酸水溶液，15ml二次水依次清洗，挤干，置于50℃干燥箱烘干；b.水解：取清洗好的鸡毛样品剪碎，置于50ml塑料离心管中，加入50.0μl1.0mg/l氧氟沙星-d3工作液和15.0ml2.0％(v/v)过氧化氢和2％(v/v)甲酸甲醇溶液，室温超声60min，获得畜禽毛发水解液；c.净化：畜禽毛发水解液用二层医用纱布过滤，加入10.0ml正己烷，振荡10.0min，4000转/分钟离心5min，弃去上层正己烷溶液，下层水解液在40℃-50℃氮吹近干，加入1.0ml甲醇水溶液(1:1，v/v)溶解残渣，过0.22mm滤膜，作为供试品溶液。(2)高效液相色谱-串联质谱法检测液相色谱条件：色谱柱：c18，2.1mm×100mm，1.8μm；流动相a为含0.1％(v/v)甲酸水溶液，流动相b为甲醇，流速：0.4ml/min；柱温：35℃；进样量：10.0μl；梯度洗脱程序：0-2min，2％b线性变化至30％b；2-4min，保持30％b；4-4.1min，30％b线性变化至60％b；4.1-6min，保持60％b；6-6.1min，60％b线性变化至98％b；6.1-7min，保持98％b；7-7.1min98％b降为2％b；7.1-8.0min，维持2％b；质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式；多反应检测：喷雾电压：3000v，离子源温度，150℃，鞘气温度：300℃；鞘气流量：12l/min。氧氟沙星的定量离子为m/z362>318.1，定性离子为m/z362>261.1和氧氟沙星-d3的定量离子为m/z365.1>321.1。检测结果，上述样品中氧氟沙星的残留量在60.7μg/kg-574.6μg/kg之间，未喂养氧氟沙星的鸡毛样品未检出氧氟沙星残留，部分色谱图见图1-3，说明该检测方法具有可行性。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12