一种检测猪血浆中替米考星的前处理方法与流程

本发明涉及兽药代谢临床检测技术领域，特别是一种针对猪血液样品的替米考星前处理方法，适用于临床试验动物血液中替米考星检测的样品前处理。

背景技术：

替米考星（tilmicosin）是一类半合成的大环内酯类的畜禽专用抗生素，能够有效抵御革兰氏阳性菌和某些阴性菌，以及抵抗猪繁殖呼吸系统综合症病毒的作用，已广泛应用于防治猪呼吸道疾病。因此畜牧业生产的药物代谢临床试验中经常要求对猪血液样品进行检测。

目前，替米考星兽药的临床药代检测方法主要采用高效液相色谱法（hplc），中国兽药典（2015版）与美国药典以及国标（农业部958号公告）均采用hplc检测标准。但这这些样品处理方法主要针对替米考星制剂、牛奶以及可食性动物组织，并不适用于动物血液样品检测。而兽药申报审批过程中药代动力学报告必须包括动物血液样品检测，现有的检测体系并不能满足检测的需求。

目前血液样品替米考星的前处理方法主要采用化学溶剂法和固相萃取法，但前者须耗用大量化学试剂，对环境造成破坏；后者并没有开发出专门针对动物血液样品（尤其像猪血这种富含蛋白和脂肪的情况）的固相萃取方法，一般参考牛奶国标前处理方法，但猪血样经实践证明采用目前的报道方法处理，效果很不理想，存在柱子成本高、过柱易堵塞、回收率低、杂质去除不完全等问题。

此外，猪血素有“液态肉”美称，其富含了多种维生素、蛋白质、铁、磷、钙、尼克酸等营养成分。蛋白质含量高于日常食用的瘦猪肉，因此在检测时增加了样品处理难度。而传统的化学溶剂抽提法以及目前报道的固相萃取方法均无法满足猪药代分析要求。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在建立一套专门针对猪血液样品的快速便捷前处理方法，满足临床药代分析。

为实现上述发明目的，本申请采用如下技术方案：

⑴样品提取：

取1猪ml血浆，加入0.75ml质量分数为10%的高氯酸，12000rpm离心15min，取上清；

⑵固相萃取净化：

将spe柱（c18，100mg5ml）置于固相萃取装置上，先用10ml甲醇活化、10ml超纯水进行平衡；然后取步骤（1）获得的上清过spe柱；再依次用10ml质量分数为5%的氨水、5ml质量分数为35%的乙腈淋洗；65-80kpa压强下抽干10min后，用5ml洗脱液洗脱于试管中，再将其置于30℃金属浴条件下用氮气吹至干燥；最后用流动相将其溶解，精确定容至2ml；然后涡旋60s，静置10min，0.22μm滤膜进行过滤，即完成替米考星的前处理。

进一步，本发明所述一种检测猪血浆中替米考星的前处理方法中，所述血浆是通过如下方法获得的：

将采集的新鲜猪血样5ml，置于含有0.5ml质量分数为1%肝素钠的离心管中（肝素钠与新鲜血样的质量比为1:1000），3500rpm离心10min,静置分层，上层即为血浆。

进一步，本发明所述洗脱液制备方法如下：取乙酸铵7.71g溶解于200ml甲醇中，再加入790ml乙腈，即得；（即“农业部958号公告-1-2007牛奶中替米考星残留量测定高效液相色谱法”4.2.9公开的洗脱液制备方法）。

进一步，本发明所述流动相制备方法如下：取110ml乙腈、55ml四氢呋喃、25ml1mol/ldbap，加入700ml水中，过滤、脱气，即得；（即“农业部958号公告-1-2007牛奶中替米考星残留量测定高效液相色谱法”4.4.5.1公开的流动相制备方法）。

与现有技术相比，本申请技术方案具有以下技术效果：

1、本发明优化了提取溶剂配方：传统的一般采用二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙腈提取，但对猪血样蛋白沉淀效果并不理想，并且导致后续固相萃取堵塞问题以及液相分析背景噪音过大等问题；本发明采用质量分数为10%高氯酸，不仅能够迅速去除大量蛋白质，而且提高了对替米考星的提取效率，从源头上解决了药物提取难的问题。

2、本发明优化了固相萃取条件：现有的固相萃取一般选用500mgc18固相萃取小柱，但在猪血液样品处理中并不适用，一方面因柱容量加大造成的过柱时间延长，另一方面则是加大了测试成本，本发明采用了100mgc18固相萃取小柱，在此基础上优化了固相萃取条件参数，既缩短了过柱时间，也节约了测试成本。

3、本发明优化了淋洗步骤中的试剂参数，从现有的纯水和乙腈，改为10ml质量分数为5%的氨水（淋洗液1）、5ml质量分数为35%的乙腈（淋洗液2），既对杂质（如蛋白和脂肪）进行了有效去除，又对目标化合物替米考星进行了最大程度地保留。

4、本申请对上样量和最终洗脱体积进行了参数优化，将上样量改为常规用量的一半，减少了杂质引入，并将洗脱体积相应提高了1倍，从而提高了样品回收效率。

附图说明

图1为实施例2获得的替米考星标准曲线；

图2为检测色谱图；

其中，图2（a）为猪空白血浆色谱图，图2（b）为空白血浆添加5μg·ml^-1替米考星的色谱图；

具体实施方式

以下实施例中血浆的提取方法如下：

将采集的新鲜猪血样5ml，置于含有0.5ml质量分数为1%的肝素钠的塑料离心管中，3500r/min离心10min,分层，上层即为血浆。

以下实施例中，未明确说明配制方法的试剂及仪器参数，均参见文献“农业部958号公告-1-2007牛奶中替米考星残留量测定高效液相色谱法”。

实施例1优化对比实验

1、提取液优化实验

对比组：采用牛奶农业部国标国标处理（参见“农业部958号公告-1-2007牛奶中替米考星残留量测定高效液相色谱法”），其具体步骤如下：

取2ml血浆+6ml乙腈，涡旋30s，超声1min,6000r/min离心5min，取上清，过500mg3ml安普小柱，发现柱堵塞（大量的脂肪凝聚成胶状物质，导致样品极度粘稠），从提取到固相萃取结束，纯靠自然重力沉降，共计7h。

实验组：采用高氯酸提取，其具体步骤如下：

取1ml血浆+0.75ml高氯酸（质量分数10%），8000g离心10min;换用spe柱（bondelutec18，100mg5ml），发现过滤头不赌了，从提取到固相萃取结束，纯靠自然重力沉降，共计1h左右。

2、固相萃取条件优化实验

对比组：

先后用10ml甲醇活化、10ml水进行平衡，取2ml血浆高氯酸提取后的上清上样，再用10ml纯水和10ml乙腈先后洗涤，待溶液完全从spe柱流出后，再将真空泵的压力调小，让spe柱在真空条件下干燥不低于５min，精确量取2.5ml洗脱液过spe柱，洗脱于试管中，再将其置于30℃水浴条件下用氮气吹至干燥。最后用流动相将其溶解，精确定容至2ml。涡旋60s，静置10min，0.22μm的针孔式滤膜进行过滤。发现5μg加标回收率为43.68%

实验组：采用高氯酸提取：

先用10ml甲醇活化、10ml超纯水进行平衡；取1ml血浆高氯酸提取后的上清上样；再用10ml5%氨水、5ml35%乙腈淋洗；强力抽干10min后，5ml洗脱液洗脱于试管中，将其置于30℃金属浴条件下用氮气吹至干燥；最后用流动相将其溶解，精确定容至2ml。涡旋60s，静置10min，0.22μm滤膜进行过滤，供hplc分析。发现5μg加标回收率为86%。

实施例2猪血浆替米考星检测预处理

1、样品药物提取

取猪血5ml，置于含有肝素钠的塑料离心管中，3500r/min离心10min,吸取上层血浆，备用；

2、将spe柱（bondelutec18，100mg5ml）置于固相萃取装置上，先用10ml甲醇活化、10ml超纯水进行平衡；然后精确量取1ml猪血浆样品，添加0.75ml10%高氯酸，12000r/min离心15min，取上清过spe柱；再用10ml5%氨水、5ml35%乙腈淋洗；强力抽干10min后，5ml洗脱液洗脱于试管中，将其置于30℃金属浴条件下用氮气吹至干燥；最后用流动相将其溶解，精确定容至2ml。涡旋60s，静置10min，0.22μm滤膜进行过滤，供hplc分析。

3、色谱条件

选择agilenttc-c18（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱；以水－乙腈－磷酸二丁胺溶液－四氢呋喃（805:115:25:55）为流动相；流速1.0ml·min-1，柱温为30℃，检测波长为290nm；进样量为40μl。

4、标准曲线绘制

用流动相将替米考星标准储备液分别稀释成0.05、0.5、2.5、10和20μg·ml^-1的标准工作溶液，进行hplc分析。以浓度为横坐标，峰面积（顺式和反式异构体的峰面积之和）为纵坐标，绘制标准曲线。

5、检测限和定量限的检测

取空白血浆样品，添加标样，采用倍比稀释，按上述样品前处理方法进行处理，测定色谱系统的基线噪音值，按信号强度与噪声强度比（s/n）为3作为检测限（lod），s/n=10为定量限（loq）。

6添加回收率及精密度试验

取血浆1ml，添加一定体积的储备液，使血浆中药物质量浓度为0.05、0.50和5μg·ml^-1，按上述样品前处理方法分别处理后进行hplc测定。每日每个浓度取5个平行样品，测定3天，并计算回收率和精密度。

6、结果与分析

6.1标准曲线

在药物浓度0.05～20μg·ml^-1范围内，替米考星峰面积（顺式和反式异构体的峰面积之和）与浓度呈线性相关，得到其回归方程是y=674366x－37579，r²=0.998。该曲线线性范围较宽，而且线性关系良好，满足了后续分析需求。标准曲线如图1所示。

6.2检测限和定量限

采用空白血浆加标，连续倍比稀释，求得血浆中lod和loq为别为1.32μg/l和4.41μg/l，结果如图2所示，其中图2（a）为猪空白血浆色谱图，图2（b）为空白血浆添加5μg·ml^-1替米考星的色谱图。

6.3回收率及精密度

当替米考星为0.05、0.5和5μg·ml^-1时，猪血浆中药物提取的平均回收率分别为113%、82.83%和86%，日内精密度为2.38%～3.02%，日间精密度3.87～5.33%，具体见表1。

表1回收率及精密度试验结果

由表1可见，本实施例猪血浆处理方法和检测方法可靠，重复性好，回收率和变异系数都达到了药代动力学试验指导原则的要求，能满足后续药代动力学分析。