本发明涉及南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的高效提取方式及超高效液相色谱-质谱联用检测方法，属于医药、食品和化工技术领域。
背景技术
孕酮，分子式：c21h30o2，分子量：314.46。孕酮是由卵巢黄体和胎盘分泌的一种天然孕激素。孕酮是结晶型粉末，性质稳定，不溶于水，在乙醇、甲醇等有机溶剂中易于溶解。可用于治疗闭经、异常子宫出血、先兆流产、痛经等。保胎作用：卵巢排卵后产生孕激素，促进子宫内膜腺体生长，子宫充血，使子宫内膜增厚，利于受精。受孕后，孕激素可减少妊娠期子宫收缩，使胎儿安全生长。是一种活性极强的孕激素药物。医疗上应用广泛。氢化可的松，分子式：c21h30o5，分子量：362.46。氢化可的松是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，抗炎作用较强，也具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等，并有留水、留钠及排钾作用。雌三醇，分子式：c18h24o3，分子量：288.38。白色结晶粉末，密度为1.255g/cm3，熔点为280-282℃(lit.)，沸点为469℃at760mmhg。雌三醇的雌激素活性较小，对血管、下丘脑-垂体-性腺反馈系统和造血系统都有明显作用，能选择性地作用于女性生殖道远端和男性乳腺、睾丸、前列腺等处。常用于白细胞减少，各种月经病及妇女更年期综合征等。特点为对阴道和子宫颈管有选择性作用，而对子宫体及子宫内膜无影响。此外，尚有升高外周白细胞作用，还能降低血管的通透性和脆性。
南极磷虾(euphausiasuperba)，主要生活在南极洲的南冰洋水域，是南极洲生态系统的重点物种，为鲸鱼、海豹、企鹅等提供了重要的食物来源。南极磷虾储量巨大，并多以群居方式生活，易采集捕捞。南极磷虾含有丰富的脂类和高质量的蛋白质，具有巨大的应用价值。目前，对于南极磷虾的应用主要集中于作为鱼类饵料以及加工磷虾油保健产品。海洋生物因其特殊的生存环境而有不同于陆生生物的代谢途径，一直是发现新药先导的天然宝库，世界上有70％的药物来源于海洋。南极磷虾中生物活性物质丰富，与其生存的低温、低盐的特殊海洋生存环境不无关系，目前对于南极磷虾中关于孕酮、氢化可的松和雌三醇的研究近乎空白。因此，开发一种脱脂南极磷虾中提取及检测孕酮、氢化可的松和雌三醇的方法，对于南极磷虾资源的开发利用具有十分重要的意义。此外，对于评估南极磷虾及其产品的安全性以及评估南极水域的污染情况，也有重要意义。
现有技术中公开的关于孕酮、氢化可的松的提取检测有孙利东等人从牛奶和鸡肉中经β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶水解，加入乙腈超声提取孕酮、氢化可的松，但是该方法操作时间长，且酶水解的操作条件苛刻。但是尚无从南极磷虾或其相近的水生物中提取检测孕酮、氢化可的松。关于雌三醇的提取有王宏亮等人从水产中采用甲醇超声提取，徐英将等人通过乙酸乙酯提取，hlb固相萃取柱净化，提取液氮吹至干，残渣用甲醇水溶解的方法从水产中提取8种含雌三醇的雌激素。但是这些方法并不适合应用于高脂类和高蛋白质的南极磷虾。此外，已有的孕酮、氢化可的松和雌三醇的检测方法采用放射性免疫，气相色谱-质谱联用，高效液相色谱-质谱联用等，酶联免疫,薄层层析等等。放射性免疫操作较复杂，需要的仪器昂贵，孕酮和氢化可的松为非挥发性物质，需要进行硅烷甲基化或乙酰化反应转化为挥发性的成分才能进行gc-ms测定，酶联免疫灵敏度较高，但方法假阳性高，只能用于定性初筛。薄层层析是一种半定量检测方法，检测迅速，操作简便，但检测限高，需要的材料较多。超高效液相色谱-质谱联用检测是一种新的色谱方法，具有颗粒填料小，系统体积低，收集数据快速，柱效高，分离时间短，溶剂消耗较少等优点，是一种优于高效液相色谱-质谱检测方法。因此，本发明提供一种适合南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取以及检测方法。
技术实现要素：
基于上述问题，本发明的目的是提供一种适合从南极磷虾中大量的提取孕酮、氢化可的松和雌三醇的方法及检测方法。该提取方法中只需要通过采用不同的净化柱即可得到高含量的孕酮、氢化可的松和雌三醇，方法操作简单，提取充分，除杂良好。本发明利用超高效液相色谱进行检测，在前期研究中发现，其对南极磷虾中类固醇激素的检测限低，所用样品量少，是一种准确、可靠的适用于南极磷虾泼尼松龙的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
在前期对南极磷虾类固醇激素的研究中发现，南极磷虾中含有的类固醇激素类物质种类很多，都属于脂溶性的物质，而且南极磷虾体内脂含量及虾青素含量十分高，提取物呈鲜艳红色，给提取和检测造成了很大的困难。但发明人发现，获得高含量的孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取方法比较接近。因此，本发明的第一个方面，是提供一种南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取的方法，步骤如下：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入甲醇，涡旋提取，保留上清液；
(3)向步骤(2)的沉淀中加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液，涡旋提取，取上清；
(4)将步骤(2)和(3)中的上清液用quechers固相萃取柱或者hlb固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液。
(5)旋转蒸发至干，用甲醇复溶，过0.2μm滤膜，得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取物。
优选地，在本发明的一个实施例中，公开了一种南极磷虾中孕酮和氢化可的松的提取方法，步骤如下：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入甲醇，涡旋提取，保留上清液；
(3)向步骤(2)的沉淀中加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液，涡旋提取，取上清液；
(4)将步骤(2)和(3)中的上清液用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液。
(5)旋转蒸发至干，用甲醇复溶，过0.2μm滤膜，得到南极磷虾中孕酮和氢化可的松的提取物。
优选地，在本发明的另一个实施例中，还公开了一种南极磷虾中雌三醇的提取方法，步骤如下：
(1)将新鲜南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥后粉碎；
(2)向步骤(1)粉碎后的南极磷虾中加入甲醇，涡旋提取，保留上清液；
(3)向步骤(2)的沉淀中加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液，涡旋提取，取上清液；
(4)将步骤(2)和(3)中的上清液用hlb固相萃取柱萃取处理，涡旋净化，离心，取上清液；
(5)旋转蒸发至干，用甲醇复溶，过0.2μm滤膜，得到南极磷虾中雌三醇的提取物。
为了获得尽可能高的提取效率，本发明对提取溶剂进行优化选择，在初期发现，提取常用的提取剂有乙醚、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、三氯甲烷等。乙醚、三氯甲烷毒性较大，而且有些常用溶剂可以大量的提取到南极磷虾体内的脂及虾青素(根据提取物颜色可快速判断)，本发明不采用这些溶剂，经过筛选，本发明优选出三种对南极磷虾脂肪、虾青素的提取效果相对较差且安全的溶剂作为本发明的提取溶剂，分别为甲醇、乙腈和乙酸乙酯。本发明分别对比了甲醇、乙腈和乙酸乙酯，在试验中发现，用乙酸乙酯提取后乳化现象比较严重，即使经过一定时间离心后仍无明显效果，甲醇提取效果最好，所以综合考虑，本发明选用甲醇作为孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取溶剂。
由于溶剂提取后的沉淀中还存在较高含量的与蛋白质呈结合态的目标物，为了使目标物充分的提取，本发明通过对其进一步水解，使孕酮、氢化可的松和雌三醇充分提取完全。β－葡萄糖苷酸酶，是一种酸性水解酶，该酶在组织中能分解葡萄糖苷键，对类固醇的葡萄糖苷键可以从非还原的未端进行分解，可以将类固醇激素孕酮、氢化可的松和雌三醇释放出来。此外发现，氢氧化钠碱水解也可使类固醇激素孕酮、氢化可的松和雌三醇释放出来。所以，发明人比较了β－葡萄糖苷酸酶和氢氧化钠以及水解(不水解)，结果发现，在孕酮、氢化可的松和雌三醇提取时，利用氢氧化钠水解可以提高孕酮、氢化可的松和雌三醇含量，且水解时间短。
由于南极磷虾中油脂含量高，采用上述溶剂提取后，主要干扰物为油脂、有机酸、色素，其中油脂不会吸附在液相色谱仪的进样口及色谱仪中，导致目标的检测灵敏度下降，同时还会干扰目标物的测定。因此，本发明的目标在于去除脂肪、有机酸、色素等干扰物。理想的净化过程不仅可以有效的去除干扰物质，得到可靠的结果，同时又不会对目标检测物造成过多的损失，得到准确的结果。所以发明人优选出c18柱、quechers柱和hlb柱并通过比较分析，发现对于孕酮和氢化可的松，采用quechers柱化效率高，净化速率高，可以除去影响检测的杂质，而对于雌三醇，采用hlb柱净化效果最佳。
上述提取方法中，优选地，步骤(1)中将南极磷虾在-10℃至-50℃条件下冷冻干燥，优选冷冻干燥的温度是-40℃。冷冻干燥一方面可以去除水分，因为水分会对提取有影响，会使水溶性蛋白杂质提取出；另一方面，可避免南极磷虾酶解变质，南极磷虾体内的酶含量特别高，当处于温度较高的条件下，几小时之后虾就会发黑发臭。南极磷虾体内的酶含量特别高，当采用鲜虾进行酶解时，放置在常温37℃条件下酶解，几小时之后虾就会发黑发臭。
优选地，步骤(1)中，采用高速组织粉碎机研磨粉碎。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎，是为了增大南极磷虾与酶以及溶剂的接触面积，使水解充分，使提取充分。粉碎处理，可以显著增加提取效率。
优选地，步骤(2)中，甲醇的体积为10～30ml，采用甲醇涡旋提取，甲醇能够提取出孕酮、氢化可的松雌三醇，提取出其他的杂质较少，采用涡旋提取，提取方式简单，提取效率高，每次涡旋提取1-3min,优选的时间为每次涡旋2min，重复提取三次。
优选地，步骤(3)中，涡旋提取1～3min，优选涡旋提取2min.
优选地，步骤(3)中，离心为3500～4500r/min离心3～7min，优选为40000r/min离心5min。
优选地，步骤(3)中，采用ph＝12的氢氧化钠缓冲液水解结合态的孕酮、氢化可的松和雌三醇，与酶水解相比，碱水解操作简便，水解时间短，且能够完全水解结合态的孕酮和氢化可的松，且酶水解的操作条件苛刻。
优选地，步骤(4)中，采用quechers固相萃取柱萃取，可除去有机酸，色素等杂质，但不会去除孕酮和氢化可的松，采用hlb固相萃取柱萃取，可除去有机酸，色素等杂质，但不会去除雌三醇，操作简单迅速，可以达到快速净化的目的。涡旋时间1-4min，优选为2min。
优选地，步骤(4)中，离心为3500～4500r/min离心3～7min，优选为4000r/min离心5min。
优选地，南极磷虾与氢氧化钠缓冲液的加入量(g/ml)比为1～3:0.5～1.5。
优选地，步骤(5)中，甲醇复溶的体积为1～3ml，旋转蒸发的温度为30-60℃，优选旋转蒸发的温度为50℃。采用甲醇复溶可以使用较少的体积去最大限度的将旋蒸得到的物质溶解，这样可以使用较少的溶剂，溶解大多数的物质，一方面防止激素的损失，另一方面相当于提高了激素类物质的浓度。
本发明的第二个方面，提供一种采用上述方法提取的孕酮、氢化可的松和雌三醇的检测方法，采用超高效液相色谱-质谱法，液相条件为：色谱柱：acchromunitaryc18柱，2.1mm×150mm，粒径5μm。柱温：30～35℃，进一步的，柱温为30℃，样品温度10～15℃，进一步的，样品温度为10℃，进样体积10μl；流动相条件为：a相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，b相为甲醇，进一步的，a相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3ml/min，进一步的，流速为0.2ml/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相a20％→30％，流动相b80％→70％；8～10min，流动相a30％→35％，流动相b70％→65％；色谱条件为：电喷雾离子源，多反应离子检测模式，电离电压3.5kv,毛细管温度350℃，蒸汽温度300℃，脱溶剂气(n2)，脱溶剂气流量800l/h，其它参数见表1：
本发明的第三个方面，还提供了通过上述提取方法得到的含雌三醇、孕酮和氢化可的松的产品。
本发明取得了以下有益效果：
1、本发明首次以南极磷虾为材料提取孕酮、氢化可的松和雌三醇，甲壳动物中雌三醇、孕酮和氢化可的松为痕量，而南极磷虾体内脂含量及虾青素含量十分高，提取物呈鲜艳红色，极大的影响了痕量雌三醇、孕酮和氢化可的松的检测。本发明首先利用甲醇涡旋进行充分提取，耗时短，提取得率高，杂质较少；其次，对溶剂提取后是沉淀采用氢氧化钠进一步水解提取，将结合态的孕酮、氢化可的松和雌三醇水解释放出来，水解更彻底，实现雌三醇、孕酮和氢化可的松完全提取的作用；然后又并通过quechers萃取柱或hlb萃取柱净化，除去影响检测的杂质，净化效率高，净化速率高。因此，本发明整个过程对目标物提取非常充分，而且操作简单，耗时短，还可以充分除质。
2、本发明优选出的超高效液相色谱进行检测，对于南极磷虾中雌三醇、孕酮和氢化可的松的检测限低，所用样品量少，采用梯度洗脱，操作简单，峰面积定量准确可靠，是一种准确、可靠的适用于南极磷虾雌三醇、孕酮和氢化可的松的检测方法。
2、目前对于南极磷虾中激素的检测尚未有研究报告，本发明对南极磷虾中雌三醇、孕酮和氢化可的松的高含量检测可以评估南极磷虾产品及其水域的安全性，进一步可以探讨南极磷虾的生理、生化、生长和生存机制，以及为后期天然药物的开发提供基础。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明所用试剂和材料如下，未特殊指出的是常规试剂或通过常规途径即可购买得到。
quechers固相萃取柱，成分为50mgpsa,50mgc18，150mgmgso4，型号：copure-2ml，中国copure公司。
hlb固相萃取柱，型号：watersoasis-60mg/3ml，美国waters公司。
实施例1：超高效液相条件的摸索
本发明中超高效液相色谱条件的选择，考察了甲醇，水；甲醇，乙腈；甲醇，甲酸水作为洗脱剂的洗脱效果，甲醇，水的分离效果不好，后来采用甲醇、乙腈作为流动相，发现几乎所有激素都在3min内出峰，且都很难分开，之后采用甲醇、0.1％甲酸水作为流动相，发现采用一个梯度分离效果不好，经过不断调节流动相，发现甲醇和0.1％的甲酸水采用梯度分离的效果较好，并能在9min之内完全出峰，最后确定为检测孕酮、氢化可的松和雌三醇激素的流动相。
考虑到流速越大，离子化的效率越低，一般流量的选择会在0.2ml/min-0.3ml/min之间，灵敏度较为理想，同时，流速还应该适应所选择的色谱柱，选择适当的流量才会有较好的分离效率，为了兼顾离子化的效率和色谱柱的分离效率，流速最终设定为0.2ml/min。
本发明中对质谱条件的摸索和优化，利用流动注射泵连续进样，在正离子和负离子模式下进行全扫描，选择合适的分子离子峰和电离方式，探索响应信号最高的子离子，并确定定量离子。孕酮和氢化可的松采用负离子模式，雌三醇采用正离子模式进行电离。并确定碰撞能，特征离子。确定最佳检测质谱条件。
因此，本发明最终确定的超高效液相色谱和质谱条件如下：
液相色谱条件：色谱柱：acchromunitaryc18柱，2.1mm×150mm，粒径5μm。柱温：30～35℃，进一步的，柱温为30℃，样品温度10～15℃，进一步的，样品温度为10℃，进样体积10μl；流动相条件为：a相为0.1～0.2v/v％的甲酸水溶液，b相为甲醇，进一步的，a相为0.1v/v％的甲酸水溶液；流速为0.2～0.3ml/min，进一步的，流速为0.2ml/min；梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相a20％→30％，流动相b80％→70％；8～10min，流动相a30％→35％，流动相b70％→65％；质谱条件如下：电喷雾离子源，多反应离子检测模式(mrm)，电离电压3.5kv，毛细管温度350℃，蒸汽温度300℃，脱溶剂气(n2)，脱溶剂气流量800l/h；其它参数见表1：
表1质谱条件参数
实施例2：提取条件的优化筛选
1、固相萃取柱的优化筛选
hlb柱或c18柱：取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入10ml甲醇，涡旋提取2min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液5ml，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，采用hlb固相萃取柱或c18柱进行净化，具体净化方式为：首先采用6ml水和6ml甲醇冲柱，放入样品后，用6ml水冲柱，之后接nh2柱，用8ml甲醇冲柱洗脱，收集洗脱液，浓缩至1ml，过0.2μm有机滤膜。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的粗提物。将粗提物用上述确立的超高效液相色谱质谱进行检测。
quechers柱：
区别在于：用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，甲醇复溶，过0.2μm滤膜。
本发明考察了采用hlb固相萃取柱，c18固相萃取柱，quechers固相萃取柱分别作为净化柱，对于南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取检测效果进行考察，对于提取的南极磷虾的孕酮、氢化可的松和雌三醇粗提取进行上样，上样量10μl，得到不同溶剂提取的每10μl样品液中孕酮、氢化可的松和雌三醇的含量，见下表4：
表4不同固相萃取柱对各目标产物的影响
2、提取溶剂的优化筛选
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入10ml提取溶剂，涡旋提取2min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液5ml，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用1ml提取溶剂复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的粗提物。将粗提物用上述确立的超高效液相色谱质谱进行检测。
本发明考察了采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈分别作为提取溶剂，对于南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取检测效果进行考察，对于提取的南极磷虾的孕酮、氢化可的松和雌三醇粗提取进行上样，上样量10μl，得到不同溶剂提取的每10μl样品液中孕酮、氢化可的松和雌三醇的含量，见下表2：
表2不同提取溶剂对各目标产物的影响
2、水解条件的优化筛选
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入10ml甲醇，涡旋提取2min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入5ml水解液进行水解，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用1ml提取溶剂复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的粗提物。将粗提物用上述确立的超高效液相色谱质谱进行检测。
本发明考察了采用碱水解(ph＝12的氢氧化钠，使用量5ml)、酶水解(β-葡萄糖苷酸酶(10000u/ml)，使用量50μl)、以及不水解(水)作为水解方式，对于南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的提取检测效果进行考察，对于提取的南极磷虾的孕酮、氢化可的松和雌三醇粗提取进行上样，上样量10μl，得到不同溶剂提取的每10μl样品液中孕酮、氢化可的松和雌三醇的含量，见下表3：
表3不同水解方法对各目标产物的影响
从表2～4可知，孕酮、氢化可的松和雌三醇最佳提取剂为甲醇，最佳酶解试剂为ph＝12的氢氧化钠，对于孕酮和氢化可的松，最佳的净化柱为quechers萃取柱，对于雌三醇，最佳的净化柱为hlb萃取柱，净化效果最好，因此，本发明最终确定南极磷虾中孕酮、氢化可的松和雌三醇的最佳提取方式为甲醇提取，碱水解，quechers萃取柱/hlb萃取柱净化，能够充分完全的提取南极磷虾中的孕酮、氢化可的松和雌三醇。
实施例3
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入10ml甲醇，涡旋提取2min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液5ml，涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用1ml甲醇复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松的粗提物。取10μl粗提物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测，得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松的含量分别为685.3ng/g，686.3ng/g。
实施例4
取10g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入10ml甲醇，涡旋提取2min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液5ml,涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，用hlb固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用1ml甲醇复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中雌三醇的粗提物。取10μl粗提物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测，得到南极磷虾中雌三醇的含量分别为345.2ng/g。
实施例5：
取20g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入20ml甲醇，涡旋提取1min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液10ml,涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋1min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用2ml甲醇复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松的粗提物。取10μl粗提物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松含量分别为679.4ng/g，648.5ng/g。
实施例6
取20g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入20ml甲醇，涡旋提取1min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液10ml,涡旋提取1min，4000r/min离心5min后取上清液，用hlb固相萃取柱萃取处理，涡旋1min净化，4000r/min离心5min，取上清液，旋转蒸发至干，用2ml甲醇复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中雌三醇的粗提物。取10μl粗提物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中雌三醇的含量分别为339.6ng/g。
实施例7：
取30g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入30ml甲醇，涡旋提取3min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液15ml,涡旋提取3min，4500r/min离心6min后取上清液，用quechers固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4500r/min离心6min，取上清液，旋转蒸发至干，用3ml甲醇复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松的粗提物。取10μl粗提物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中孕酮、氢化可的松的含量分别为689.2ng/g，643.9ng/g。
实施例8
取30g新鲜南极磷虾，并将其进行冷冻干燥处理，冷冻干燥的温度为-40℃。将冷冻干燥的南极磷虾用高速组织粉碎机研磨粉碎。加入30ml甲醇，涡旋提取3min，取上清液，重复提取1次，合并上清液，加入ph＝12的氢氧化钠缓冲液15ml，涡旋提取3min，4500r/min离心6min后取上清液，用hlb固相萃取柱萃取处理，涡旋2min净化，4500r/min离心6min，取上清液，旋转蒸发至干，用3ml甲醇复溶，过0.2μm滤膜。得到南极磷虾中雌三醇的粗提物。取10μl粗提物用实施例1确立的超高效液相色谱质谱进行检测。得到南极磷虾中雌三醇的含量分别为342.9ng/g。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。