基于场流分离技术检测马铃薯抗性淀粉含量及结构的方法与流程

本发明涉及马铃薯抗性淀粉检测方法，具体地说是一种基于场流分离技术检测马铃薯抗性淀粉含量及结构的方法。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，对于食用高营养、低热量的功能性食品越来越受关注。淀粉是食品行业的重要原材料，依据其在体内的消化速率和消化程度，被分为三类：快速消化淀粉、慢速消化淀粉和抗性淀粉。抗性淀粉是一种低热量、类膳食纤维的功能性食品成分，其具有与膳食纤维类似的功能且在口感和某些性能上优于膳食纤维，有助于预防糖尿病、控制体重、提高机体免疫力、预防结肠癌等功能。

马铃薯是全球第四大非谷物类主食农作物，其在国内种植面积广、产量高。马铃薯淀粉颗粒较大，表面光滑，抗性淀粉含量较高。淀粉的结构（旋转半径和分子量分布）是影响淀粉粘度特性、糊化特性、膨胀度和凝沉性的重要因素。淀粉类产品添加抗性淀粉后可维持速冻面团的质地和结构，改善膨化食品的膨化度和脆性，防止酸奶中的益生菌死亡，提高焙烤食品口感、颜色和质地。因此对马铃薯抗性淀粉含量及其结构表征具有重要意义。

现有的检测马铃薯抗性淀粉主要方法是megazyme抗性淀粉试剂盒法（aoac法2002.02）：样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶（amg）37℃水浴振荡孵育16h，通过两种酶的联合作用，非抗性淀粉被水解成d-葡萄糖，孵育结束后，加入等体积的乙醇终止反应。离心上述溶液，得到的固体加入2m（mol/l）koh溶解，在冰水浴中剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将溶液调至中性，用amg将淀粉水解成d-葡萄糖。d-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂（gopod）测定，得到抗性淀粉含量。

但是，aoac试剂盒法检测马铃薯抗性淀粉含量成本高、耗时长、且无法同时提供抗性淀粉的旋转半径和分子量分布信息。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种基于场流分离技术检测马铃薯抗性淀粉含量及结构的方法，以解决aoac试剂盒法检测马铃薯抗性淀粉含量成本高、耗时长、且无法同时提供抗性淀粉的旋转半径和分子量分布信息的问题。

本发明是这样实现的：一种基于场流分离技术检测马铃薯抗性淀粉含量及结构的方法，包括如下步骤：

a、水解马铃薯非抗性淀粉；

a-1、称取适量马铃薯淀粉于样品瓶中，向其中加入醋酸钠缓冲液，之后于37℃水浴中预热；

a-2、向样品瓶中加入α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的混合酶；

a-3、160rpm连续搅拌，并在37℃水浴中孵育2h；

a-4、将样品瓶从37℃水浴转至90℃水浴中，静置，灭活消化酶；

a-5、将样品瓶从90℃水浴中取出，自然冷却至室温；

b、溶解马铃薯抗性淀粉；

b-1、取步骤a-5中样品于样品瓶中，加入naoh溶液，70℃水浴，400rpm磁力搅拌，溶解抗性淀粉；

b-2、加入非对称场流分离所用载液，非对称场流分离所用载液为nano3和nan3的水溶液，70℃水浴，400rpm磁力搅拌；

b-3、加入hcl溶液，70℃水浴，400rpm继续磁力搅拌；

b-4、将样品瓶从水浴中取出，自然冷却至室温；

c、采用场分离技术测定马铃薯抗性淀粉；

采用非对称场流分离联用多角度激光光散射检测器和示差折光检测器，对步骤b-4所得样品进行分析，得到抗性淀粉的dri峰面积m1以及旋转半径和分子量分布；

d、检测马铃薯抗性淀粉含量；

d-1、称取适量马铃薯淀粉于样品瓶中，加入naoh溶液，70℃水浴，400rpm磁力搅拌；

d-2、加入非对称场流分离所用载液，非对称场流分离所用载液为nano3和nan3的水溶液，70℃水浴，400rpm磁力搅拌；

d-3、加入hcl溶液，70℃水浴，400rpm继续磁力搅拌；

d-4、将样品瓶从水浴中取出，自然冷却至室温；

d-5、采用非对称场流分离联用多角度激光光散射检测器和示差折光检测器，对步骤d-4所得样品进行分析，得到马铃薯淀粉的dri峰面积m2；

d-6、依据如下公式计算马铃薯抗性淀粉含量：

马铃薯抗性淀粉含量=m1/m2×100%。

步骤c和步骤d-5中采用非对称场流分离联用多角度激光光散射检测器和示差折光检测器对样品进行分析时，检测器流速为1ml/min；洗脱流速是指数衰减交叉流流速，19min内由1.4ml/min降至0.05ml/min，半衰期为4min。

非对称场流分离所用载液为nano3和nan3的水溶液，且nano3为50mm，nan3为3mm，载液的ph为7.00。

本发明采用非对称场流分离联用多角度激光光散射检测器和示差折光检测器检测马铃薯抗性淀粉含量，该方法检测马铃薯抗性淀粉全过程4小时，耗时短；同时可以提供抗性淀粉旋转半径和分子量分布。而且，本发明中的方法采用50mmnano3+3mmnan3的水溶液作为流动相，成本低。本发明与目前通用的aoac抗性淀粉检测法相比具有明显的优势。

附图说明

图1是马铃薯抗性淀粉的旋转半径分布图。

图2是马铃薯抗性淀粉的分子量分布图。

具体实施方式

本发明所提供的基于场流分离技术检测马铃薯抗性淀粉含量及结构的方法，包括如下步骤：

1、水解马铃薯非抗性淀粉

（1）准确称取马铃薯淀粉100mg置于20ml样品瓶中，加入6ml0.1m的醋酸钠缓冲液（ph5.2，包含1mmcacl2）。拧紧样品瓶螺帽后，置于37℃水浴中预热5min。

（2）向样品瓶中加入4.0ml混合酶（含α-胰淀粉酶（142u/ml）和amg（15u/ml））。

（3）以160rpm的速度连续搅拌，并在37℃下孵育2h。

（4）将样品瓶从37℃水浴转至90℃水浴中，放置2min，灭活消化酶。

（5）将样品瓶从90℃水浴中取出，自然冷却至室温。

2、溶解马铃薯抗性淀粉

（1）取1ml步骤1中样品，加入1ml1m的naoh溶液，在70℃下水浴，以400rpm的速度进行磁力搅拌2min，溶解抗性淀粉。

（2）加入8ml非对称场流分离所用载液（50mmnano3+3mmnan3，ph7.00），在70℃下水浴，以400rpm的速度进行磁力搅拌1h。

（3）加入1ml1m的hcl溶液，在70℃下水浴，以400rpm的速度继续磁力搅拌5min。

（4）将样品瓶从水浴中取出，自然冷却至室温后定容至10ml。

3、场流分离测定马铃薯抗性淀粉含量及结构

（1）仪器：非对称场流分离联用多角度激光光散射检测器和示差折光检测器（af4-mals-dri）。

（2）载液：50mmnano3+3mmnan3，ph7.00。

（3）进样量：50μl。

（4）检测器流速：1ml/min。

（5）洗脱流速：指数衰减交叉流流速，19min内由1.4ml/min降至0.05ml/min，半衰期为4min。具体交叉流流速检测程序见表1。

（6）马铃薯抗性淀粉样品（即上面步骤2所得样品）冷却至室温后，经af4-mals-dri分析，得到消化剩余物（抗性淀粉）的dri峰面积m1，以及旋转半径（rg）和分子量（mw）分布。

4、马铃薯抗性淀粉含量计算

（1）取10mg马铃薯淀粉，加入1ml1m的naoh溶液，在70℃下水浴，以400rpm的速度进行磁力搅拌2min。

（2）加入8ml非对称场流分离所用载液（50mmnano3+3mmnan3，ph7.0），在70℃下水浴，以400rpm的速度进行磁力搅拌2h。

（3）加入1ml1m的hcl溶液，在70℃下水浴，以400rpm的速度继续磁力搅拌5min。

（4）将样品瓶从水浴中取出，自然冷却至室温后定容至10ml。

（5）按照步骤3中的af4-mals-dri分析条件分析马铃薯淀粉（即步骤4（4）中所得样品），得到马铃薯淀粉的dri峰面积为m2。

马铃薯抗性淀粉含量=m1/m2×100%。

按照上述4个步骤即可测得马铃薯淀粉的af4-mals-dri图谱及旋转半径和分子量分布。如图1和图2所示，图1是马铃薯抗性淀粉的旋转半径分布图，图2是马铃薯抗性淀粉的分子量分布图。由图1和图2可知，马铃薯抗性淀粉的旋转半径分布范围为：19.9nm~172nm；马铃薯抗性淀粉的分子量分布范围为：2×10⁵g/mol~2×10⁸g/mol。本发明所建立的马铃薯抗性淀粉的af4-mals-dri分析方法具有较好的重现性。

马铃薯抗性淀粉的af4-mals-dri检测结果见表2。由表2可见，af4-mals-dri检测的马铃薯抗性淀粉的含量为72.3%。平均重均分子量为2.93×10⁷g/mol，平均旋转半径为87.7nm。与已有方法相比，af4-mals-dri检测马铃薯抗性淀粉全过程4小时，耗时短；分离所用载液为50mmnano3+3mmnan3的水溶液，成本低；同时可以提供抗性淀粉的旋转半径和分子量分布信息，并且具有较好的重现性。

本发明采用非对称场流分离联用多角度激光光散射检测器和示差折光检测器检测马铃薯抗性淀粉含量的方法分析时间短，同时可以提供抗性淀粉旋转半径和分子量分布。此方法采用50mmnano3+3mmnan3的水溶液作为流动相，成本低。本发明中af4法与目前通用的aoac抗性淀粉检测法相比具有一定的优势，见表3。