一种基于多元素和稳定同位素的牦牛肉产地溯源方法与流程

本发明涉及一种鉴别牦牛肉产地的方法，具体涉及一种基于多元素和稳定同位素的牦牛肉产地溯源方法。
背景技术：
：牦牛是青藏高原特有地理标志性产品，其品种特性和生存环境决定了其卓越的稀有品质。但目前市场中出现了以次充好，以假乱真的现象。鉴于此，为了保护牦牛肉在市场上的独特性和真实性，牦牛生产及销售过程需要一套适用的监测方法进行牦牛肉的溯源。在农产品溯源中，最常见的溯源方法是物理方法和化学方法，但由于物理方法，如动物身份证、射频识别(radiofrequencyidentification,frid)等技术容易出现信息丢失、混乱、人为修改等缺点，化学方法(如稳定性同位素指纹分析溯源技术、矿物元素指纹分析溯源技术及有机成分指纹溯源技术)基于其基本原理，成为农产品有效的溯源首选技术，越来越受到重视。但由于牦牛常年在野外放牧，生长环境较圈养动物复杂，单一化学方法溯源技术并不理想。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于多元素和稳定同位素的牦牛肉产地溯源方法。本发明利用稳定性同位素指纹技术和矿物元素指纹分析技术组合，区分牦牛肉产地，并利用客观检测分析方法，快速判别牦牛肉样品的产地来源，提高溯源的准确性。本发明所采用的技术方案如下。一种基于多元素和稳定性同位素的牦牛肉产地溯源方法，(1)采集牦牛肉样品，预处理，得到脱脂牦牛肉样品；(2)检测脱脂牦牛肉样品中稳定碳同位素丰度比、稳定氢同位素丰度比，以及矿物元素ti含量；(3)依据稳定碳同位素丰度比、稳定氢同位素丰度比，计算得到稳定碳同位素比率δ13c‰、稳定氢同位素比率δ2h‰；(4)将稳定碳同位素比率δ13c‰、稳定氢同位素比率δ2h‰，以及矿物元素ti含量代入判别模型，根据计算结果，判断出牦牛肉样品的产地。下面对上述方法作进一步说明。步骤(1)中，所述牦牛肉样品的采集地选自青海、四川、甘肃、云南或西藏；进一步优选青海省大通县、青海省河南县、四川省红原县、四川省九龙县。所述牦牛肉采集牦牛肉背最长肌(即10-14肋骨间)。步骤(1)中，所述预处理为：将牦牛肉样品制成1cm3肉丁样品进行冷冻干燥，粉碎，脱脂处理；其中，所述冷冻干燥具体为：将样品平铺在托盘中，冷冻干燥48小时后取出；冷冻温度在-20℃--80℃之间。其中，所述脱脂处理为索氏提取，具体为：将牦牛肉样品置于全自动索氏提取仪中，浸提脱脂两小时后取出；溶剂为沸程为30℃-60℃的石油醚。步骤(2)中，所述矿物元素的含量可利用电感耦合等离子质谱仪进行检测。作为本发明优选实施方式之一，利用icp-ms检测牦牛肉中矿物元素ti的操作步骤为：(1)icp-ms自动进样器参数：样品快速提升2ml/min(0.5rps)40秒；分析前稳定0.4rps30秒；多元素同时分析0.1rps。(2)icp-ms定量分析模式：he气模式，单位质量数采集数采集点数为3，数据采集重复次数为3次，积分时间as为1sec，se、cd为2sec，pb为3sec，其他元素为0.3sec。(3)icp-ms具体工作参数：射频功率为1600w，载气流速为1.0l/min，蠕动泵流速0.1rps，雾化室温度为2℃，氧化物指标为0.45％，双电荷指标为1.01％。在矿物元素含量检测之前，先对样品进行微波消解。其中，所述消解具体为：先采用浓硝酸预消解，再采用双氧水预消解，最后进行微波消解。优选地，先采用bv3级浓硝酸消解1h，再采用双氧水预消解0.5h。进一步优选地，所述微波消解条件：微波在8min内从0℃增加至120℃，在此条件下保持2min；5min内从120℃增加至160℃，在此条件下保持5min；5min内从160℃增加至180℃，在此条件下保持15min。消解后用超纯水定容至100ml。将定容好的样品用icp-ms进行检测。步骤(2)中，所述稳定碳同位素丰度比可利用稳定同位素质谱仪进行检测。作为本发明另一优选实施方式之一，利用稳定同位素质谱仪测定稳定碳同位素丰度比的方法如下：(1)元素分析仪条件：燃烧炉温度为1020℃，还原炉温度为600℃，载气he流量为230ml/min。(2)稀释仪条件：he稀释压力为4bar，co2参考气压力为4bar。(3)质谱仪条件：用usgs24(δ13cpdb＝-16‰)标定钢瓶co2参考气，采用两点校正，用usgs24和iaea600(δ13cpdb＝-27.5‰)对测定结果进行校正。(4)相对标准为v-pdb。作为本发明另一优选实施方式之一，利用稳定同位素质谱仪测定稳定氢同位素丰度比的方法如下：(1)裂解温度为1450℃，he载气流速为120ml·min-1，h2参考气压力为4bar。(2)相对标准为v-smow。步骤(3)中，稳定同位素比率计算公式为：δ‰＝(r样品/r标准－1)×1000，式中，r代表标准物质和样品中轻重同位素与轻同位素的丰度比，即分别为13c/12c，15n/14n，2h/1h。步骤(4)中，由于牦牛肉中稳定同位素、矿物元素与其生存环境关联度非常大，因此针对不同采集地的牦牛肉，建立相应的判别模型。例如，当牦牛肉的采集地为青海省大通县、青海省河南县、四川省红原县、四川省九龙县，各自相对应的判别模型分别为：y河南县＝-5170.804-427.879δ13c-0.401δ2h+40486.142ti；y大通县＝-5348.870-435.115δ13c-0.374δ2h+44043.218ti；y红原县＝-5393.637-436.267δ13c-0.543δ2h+41929.526ti；y九龙县＝-5208.884-427.786δ13c-0.693δ2h+41771.548ti；将步骤(3)稳定碳同位素比率δ13c‰、稳定氢同位素比率δ2h‰，以及矿物元素ti含量分别代入各地判别模型，以最大y值所属地确定为牦牛肉样品所属产地。本发明所取得的有益效果如下：本发明通过对牦牛肉溯源方法的研究，发现了牦牛肉中某些特定矿物元素、稳定同位素与生存地之间的特定关系，并利用矿物元素指纹图谱溯源技术和稳定性同位素指纹技术实现了牦牛肉的溯源判别。本发明简单、方便、可操作性强，有效的减少了外界环境因素对于牦牛肉产地溯源准确性的影响，可提高了对牦牛肉产地溯源的准确性，具有快速、经济、实用的特点。可为牦牛肉质量安全追溯体系的建立和完善提供科学方法。附图说明图1为牦牛肉样品前三个主成分(pc1、pc2、pc3)标准化得分图。由图可知，大通县样品和九龙县大部分样品分别位于第二主成分的正、负两侧；河南县的样品较为集中，红原县的样品较为分散，但总体来说，提取的主成分可将四个县的样品完全区分开。图2为利用前三个主成分(pc1、pc2、pc3)标准化得分对脱脂牦牛肉中的稳定性同位素及矿物元素进行聚类分析。由图可知，前三个主成分可以将其完全区分开，效果较好。图中：1.青海省河南县2.青海省大通县3.四川省红原县4.四川省九龙县。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1本实施例提供一种鉴定牦牛肉产地真伪的方法，具体步骤如下：(1)牦牛肉样品的采集某屠宰场，牦牛肉样品：共40份，每份500g，为3～4岁母牦牛的牦牛肉背最长肌(10-14肋骨间)；标记产地分别为：青海省河南县(样品1-10)、青海省大通县(样品1-10)、四川省红原县(样品1-10)、四川省九龙县(样品1-10)；(2)牦牛肉样品干燥、粉碎、脱脂冷冻干燥：将样品切成1cm3的小丁，平铺在托盘中冷冻干燥48小时后取出；粉碎：将冻干后的样品放入行星式球磨机中进行粉碎，约1小时；脱脂：把粉碎好的牦牛肉样品进行索氏提取，在全自动索氏提取仪中，用溶剂为沸程为30℃～60℃的石油醚，浸提脱脂两小时后取出，此时为脱脂牛肉样品，备用。(3)稳定性碳同位素比率检测称取2～4mg样品放入锡箔杯中，通过自动进样器进入元素分析仪，在其内燃烧并还原转化为纯净的co2和n2，co2再经过稀释器稀释，最后进入稳定同位素质谱仪进行检测。具体的工作参数如下：元素分析仪条件：燃烧炉温度为1020℃，还原炉温度为600℃，载气he流量为230ml/min。稀释仪条件：he稀释压力为4bar，co2参考气压力为4bar。质谱仪条件：用usgs24(δ13cpdb＝-16‰)标定钢瓶co2参考气，采用两点校正，用usgs24和iaea600(δ13cpdb＝-27.5‰)对测定结果进行校正。稳定性碳同位素比率以δ13c‰表示，其中，稳定性碳同位素相对标准为v-pdb。(4)稳定性氢同位素比率检测称取0.3mg样品装入银杯(6mm×4mm)，平衡72小时，并按顺序放入120位自动进样器中，利用自动进样器将样品送入元素分析仪，高温裂解生成co和h2，最后进入稳定同位素质谱仪进行检测。具体的工作参数如下：样品裂解温度为1450℃，he载气流速为120ml·min-1，h2参考气压力为4bar。稳定性氢同位素比率以δ2h‰表示，其中，稳定性氢同位素相对标准为v-smow。稳定性碳、氢同位素测定结果的计算为：δ‰＝(r样品/r标准－1)×1000，式中，r代表标准物质和样品中轻重同位素与轻同位素的丰度比，即分别为13c/12c，2h/1h。(5)矿物元素含量的测定称取0.2g左右的脱脂后的牦牛肉粉样品，置于洁净的消解管中，加入6mlbv3级浓硝酸预消解1h，之后加入2mlbv3级双氧水预消解0.5h.放入微波消解仪中进行消解。微波消解条件：微波在8min内从0℃增加至120℃，在此条件下保持2min；5min内从120℃增加至160℃，在此条件下保持5min；5min内从160℃增加至180℃，在此条件下保持15min。消解后用超纯水定容至100ml。将定容好的样品用icp-ms进行检测。icp-ms自动进样器参数：样品快速提升2ml/min(0.5rps)40秒；分析前稳定0.4rps30秒；多元素同时分析0.1rps。icp-ms定量分析模式：he气模式，单位质量数采集数采集点数为3，数据采集重复次数为3次，积分时间as为1sec，se、cd为2sec,pb为3sec，其他元素为0.3sec。icp-ms具体工作参数：射频功率为1600w，载气流速为1.0l/min，蠕动泵流速0.1rps，雾化室温度为2℃，氧化物指标为0.45％，双电荷指标为1.01％。使用外标法进行定量。采用ge、in、bi等多元素混合作为内标，其中ge(72)作为质量数9-89各元素内标；in(115)作为质量数95-159各元素内标；bi(209)作为质量数163-238各元素内标。当内标元素rsd值大于3％时，样品需重新测定。(6)测得40个样品中矿物元素ti及稳定性碳同位素、稳定性氢同位素含量如下：表1牦牛肉样品中矿物元素及稳定性碳同位素、稳定性氢同位素含量(7)将表1中每一个样品的矿物元素ti含量以及稳定碳同位素比率δ13c‰、稳定氢同位素比率δ2h‰代入判别模型中，得到相应的y值，进而依据最大y值确定样本牦牛肉的实际溯源产地，判断出牦牛肉标记溯源产地的真假；y河南县＝-5170.804-427.879δ13c-0.401δ2h+40486.142ti；y大通县＝-5348.870-435.115δ13c-0.374δ2h+44043.218ti；y红原县＝-5393.637-436.267δ13c-0.543δ2h+41929.526ti；y九龙县＝-5208.884-427.786δ13c-0.693δ2h+41771.548ti。经检验，上述40个牦牛肉样品中，有7个样品溯源错误，具体为：判别例1：将标记为青海省河南县3号牦牛肉样品的稳定性同位素及矿物元素含量指标代入判别模型1-4中，比较各y值大小，y红原县最大，判错为四川省红原县，判定其实质属于青海省河南县。判别例2：将标记为青海省大通县4、6号牦牛肉样品的稳定性同位素及矿物元素含量指标代入判别模型1-4中，比较各y值大小，y河南县最大，两个样品均判错为青海省河南县，判定其实质属于青海省大通县。判别例3：将标记为四川省红原县2号牦牛肉样品的稳定性同位素及矿物元素含量指标代入判别模型1-4中，比较各y值大小，y河南县最大，判错为青海省河南县，判定其实质属于四川省红原县；将标记为四川省红原县7号牦牛肉样品的稳定性同位素及矿物元素含量指标代入判别模型1-4中，比较各y值大小，y九龙县最大，判错为四川省九龙县，判定其实质属于四川省红原县。判别例4：将标记为四川省九龙县2号牦牛肉样品的稳定性同位素及矿物元素含量指标代入判别模型1-4中，比较各y值大小，y河南县最大，判错为青海省河南县，判定其实质属于四川省九龙县；将标记为四川省九龙县3号牦牛肉样品的稳定性同位素及矿物元素含量指标代入判别模型1-4中，比较各y值大小，y大通县最大，判错为青海省大通县，判定其实质属于四川省九龙县。其余34个样品的产地标记正确。表2牦牛肉产地的正确判别率从表2可知，40个样品的整体正确判别率及交叉验证判别率分别为85％及82.5％。本发明所述溯源方法准确率的验证：验证a：上述四个地域脱脂牦牛肉样品中存在显著性差异的3种稳定性同位素指标和8种矿物元素指标的主成分分析(pc1、pc2、pc3)结果如表3、图1所示。表3主成分的特征向量及累计方差贡献率由表3可知，使用筛选出的指标做主成分分析，前三个主成分的累计方差贡献率为68.451％。验证b：单一同位素指标对牦牛肉产地的正确判别率选取稳定性氮同位素作为对比例，比较同位素指标对牦牛肉产地的正确判别率。表4单一同位素指标对牦牛肉产地的正确判别率采样地区交叉验证判别率δ15n/‰δ2h/‰河南县10％90％大通县60％100％红原县20％70％九龙县60％80％整体37.5％85％牦牛肉中稳定性氮同位素判别效果只有大通县和九龙县判别率为60％，整体判别率仅为37.5％，判别效果较差；稳定性氢同位素的判别率最低为70％，最高达到100％，整体判别率高达85％，判别效果明显由于稳定性氮同位素。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12