一种基于硅纳米颗粒-质谱联合检测胰岛素的方法与流程

本发明属于胰岛素检测的
技术领域：
，特别涉及一种基于硅纳米颗粒-质谱联合检测胰岛素的方法。
背景技术：
胰岛素是调节体内脂肪和碳水化合物代谢的重要物质，胰岛素的检测具有许多重要的临床意义，胰岛素检测对于糖代谢疾病的研究有着重要的作用，尤其是在低血糖病因分析，糖尿病的发病机制研究以及评估胰岛β细胞分泌功能方面有着重要的作用，其中动态检测β细胞储备胰岛素有助于临床确定糖尿病的病情和治疗方案。目前实验室检测胰岛素的常用方法主要有放射免疫分析法(ria)、酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法(clia)、电化学发光免疫分析法(eclia)等，这些检测方法或检测系统在检测胰岛素时，其检测速度、灵敏度、特异性和稳定性等方面存在着不足，使用这些数据可能对临床采用胰岛素检测结果进行辅助诊断和治疗检测带来不良影响。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms)由于其检测快速、简便、高通量等特点，被广泛用于生物分子的样品检测之中，然而，当用传统方式对胰岛素进行检测时，却发现质谱很难检测到胰岛素的数据，因此，如何建立一种高通量质谱快速定量检测胰岛素的方法成为胰岛素检测领域急需解决的技术问题。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供了一种利用纳米硅辅助高通量质谱法快速定量检测胰岛素的方法，其灵敏度高、特异性强、稳定性好。为解决上述技术问题，本发明的目的通过下述技术方案得以实现：一种基于硅纳米颗粒-质谱联合检测胰岛素的方法，所述方法包括胰岛素抗体包被硅纳米粒子，免疫富集样本中的胰岛素，洗涤除去未结合的样品组分和非特异性样品，再将富集了胰岛素的硅纳米颗粒滴加在maldi靶板上，利用maldi-tofms进行胰岛素检测。上述硅纳米粒子通过3-缩水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷(glymo)进行功能化修饰，再用胰岛素抗体包被。上述胰岛素抗体的用量为10-30μg，优选为15μg。上述样品的类型为血清或血浆，优选为血清。上述maldi检测胰岛素的基质选自α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)、2，5-二羟基苯甲酸(dhb)或芥酸(sa)，优选为α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)。上述洗涤过程使用磷酸盐缓冲液(pbs)。为了增加胰岛素的信号，主要有两种方法，一种是标记胰岛素衍生物，另一种是观察不同的纳米材料，如磁珠、石墨烯、硅纳米颗粒、银纳米颗粒和介孔硅作为基质。对于第一种方法，以丹磺酰氯、6-氨基喹啉基-n-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯、7-甲氧基香豆素-3-羧酸n-琥珀酰亚胺酯作为标记胰岛素的化学衍生化物质，表明它们不能通过化学修饰增强胰岛素ms信号；对于第二种方法，所有这些纳米颗粒都具有作为maldi共同基质的潜力，通过增加肽的解吸/电离来增强ms信号，实验结果表明，硅纳米颗粒和磁珠能有效增加胰岛素信号。然而，当使用磁珠作为共基质时，胰岛素信号不稳定。因此，硅纳米颗粒为增强胰岛素信号的最佳选择。为了选择合适的样本类型，通过检测多组临床样本，比较不同样本类型(血清和血浆)测定的胰岛素浓度，结果显示，血清和血浆均能检测出有效的信号，但血清胰岛素的信号高于血浆，因此，血清为更适合于本方法检测的样本类型。为了选择包被抗体的用量，通过检测多组抗体用量不同的样品，结果显示，当抗体量为10-30μg时，均可得到有效的信号，综合考虑用量和信号强度，15μg为最佳用量。为了选择maldi检测胰岛素的最适基质，通过使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)、2，5-二羟基苯甲酸(dhb)和芥酸(sa)为基质进行胰岛素测量，结果显示，均可得到有效的信号，但chca的信号最强，因此chca是这种胰岛素测量平台的最佳基质。本发明和现有技术相比，具有如下有益效果:1、本发明首次发现了硅纳米颗粒作为检测基质对胰岛素质谱检测，具有增强质谱信号的作用。2、本发明首次采用maldi-tofms联合硅纳米颗粒完成对胰岛素检测方法的建立。3、本发明提供的检测方法，所需样品量小，仅需100μl的样本体积即可完成检测，检测操作非常快速简便，通量高。4、本发明提供的检测方法灵敏度高，定量检测限(loq)低至0.1nm，检测信号强度与胰岛素浓度呈良好的线性关系，线性回归系数(r2)为0.99，分析内精密度(％变异系数)为1.81％～4.53％，分析间精密度为2.71％～8.09％，此外，maldi测定和化学发光免疫分析(cia)在患者样本中完成了一致性检测，并且所得到的戴明回归显示出良好的一致性(r2＝0.981)。附图说明图1是本发明不同纳米颗粒作为共基质时的胰岛素信号；图2是本发明检测有效性的胰岛素信号图；图3是本发明不同样本类型的胰岛素信号图；图4是本发明不同抗体用量的胰岛素信号图；图5是本发明不同基质的胰岛素信号图；图6是本发明检测限实验的结果图；图7是本发明检测限实验的另一结果图；图8是本发明线性实验的结果图；图9是本发明的检测方法与化学发光免疫分析方法相比较的戴明回归图。具体实施方式下面结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步描述，以下实施例并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或者改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内：本发明实施例中所使用的maldi-tofms为：美国道尔顿布鲁克公司生产的microflex系列台式基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪。所使用的纳米硅颗粒购自海洋纳米科技公司(美国)；重组人胰岛素购自肽国际公司(美国)；抗人胰岛素抗体购自abcam(美国)；其他纳米颗粒均购自海洋纳米科技公司(美国)；磁珠购自赛默飞世尔(美国)；乙腈、三甲氧基硅烷等其它试剂购自sigmaaldrich(美国)。本发明质谱检测条件为：配套的maldi检测参数为：unisonuk-c8guard-column,2.0i.d.×_5mm,intaktcorpora-tion。检测方法如下：硅纳米粒子通过clymo进行功能化修饰，胰岛素抗体包被硅纳米粒子，免疫富集样本中的胰岛素，洗涤除去未结合的样品组分和非特异性样品，洗涤使用pbs(0.01mol/l)，再将富集了胰岛素的硅纳米颗粒滴加在maldi靶板上，在n2流下干燥，最后利用maldi-tofms进行胰岛素检测。上述硅纳米粒子通过clymo进行功能化修饰的具体操作步骤为：硅纳米粒子(70亿/管)在4000g下离心20分钟，真空干燥，悬浮在3ml二甲基亚砜中，在室温下旋转混合1小时；将硅纳米粒子在4000g下制粒20分钟，乙醇洗涤3次，室温下与glymo混合1小时；孵育3小时后，将硅纳米颗粒在4000g下20分钟，用乙醇洗涤三次，然后悬浮在10ml丙酮中直到使用。上述胰岛素抗体包被硅纳米粒子的具体操作步骤为：将1ml硅纳米粒子10000g离心5分钟，真空干燥，悬浮于含15μg抗胰岛素的1mlpbs中，在25℃下混合2小时，10000g离心5分钟，在1ml200nmtris中孵育30分钟；用pbs洗涤三次，悬浮于60μl的pbs中，然后在使用前4℃保存。上述免疫富集样本中的胰岛素的具体操作步骤为：待测血清样品在冰上融化。然后在室温下，将100μl样品与ab-si纳米颗粒悬浮液孵育1小时，用pbs连续洗涤含该混合物的ab-si纳米颗粒3次；最后将富集了胰岛素的硅纳米粒子悬浮于4μlpbs中，点到质谱的靶板上进行检测分析。对照图1，使用磁珠、石墨烯、硅纳米颗粒、银纳米颗粒和介孔硅作为基质，检测胰岛素信号的强弱，图1中所示结果表明，硅纳米颗粒和磁珠能有效增加胰岛素信号，但当使用磁珠作为共基质时，胰岛素信号不稳定。对照图3，通过检测20例临床样本，比较了不同样本类型(血清和血浆)测定的胰岛素浓度。结果显示，血清胰岛素信号高于血浆。对照图4，通过检测1.25μg、5μg、10μg、15μg、20μg、25μg、30μg用量的包被抗体，结果显示，当抗体量为10-30μg时，均可得到有效的信号，综合考虑用量和信号强度，15μg为最佳用量。对照图5，以α-氰基-4-羟基肉桂酸(chca)为基质的胰岛素信号强于2，5-二羟基苯甲酸(dhb)和芥酸(sa)为基质分别进行胰岛素检测，结果显示，均可得到有效的信号，但chca的信号最强，因此chca是这种胰岛素测量平台的最佳基质。以下是本发明检测方法的方法学验证：1、方法有效性：为了验证方法的有效性，对胰岛素抗体和蛋白bsa锚定的硅纳米颗粒作为对照来评估检测性能。胰岛素标准品与两种修饰的硅纳米颗粒混合。通过洗涤除去未结合和非特异性样品后进行maldi分析。对照图2，在抗胰岛素抗体富集后，可以检测到标准胰岛素的清晰信号(图2a)；对照组中就不能识别任何信号(图2b)。这表明胰岛素可以有效被硅纳米颗粒免疫富集，并用maldi-tofms检测。2、检出限、线性和范围：对照图6和图7，该方法的定量检测限估计约为0.1nm，表明硅纳米颗粒-ms测定具有良好的灵敏度。用0.02％pbst缓冲液、5％bsa和模拟血清(白蛋白35mg/ml，转染2mg/ml，igg6mg/ml)检测，对照图8，胰岛素信号强度在0.1～25nm范围内呈良好的线性关系，线性回归系数(r2)为0.9838～0.9901。3、精密度：胰岛素测定精密度结果见表1。对于批内精密度，变异系数(cv)从1.81％变化到4.53％。对于批间精密度，cv值从2.71％变化到8.09％，两者均在10％以下。因此，硅纳米粒子ms测定具有良好的重现性和精密度。表1精密度验证4、准确度胰岛素测定准确性结果见表2。回收率在95.5％～105％之间，样品体积与测定响应之间存在线性关系。开发的纳米硅胰岛素测定技术的准确性是可以接受的。表2准确度验证胰岛素(nm)检测浓度(nm)平均回收率(％)0000.20.19195.5±1.83.03.153105±3.25、方法学比较收集40例糖尿病的临床血清样本(均为接受胰岛素治疗)同时进行本发明的检测方法和化学发光免疫分析法的检测。对照图9，研究结果显示得到的戴明回归显示本发明的检测方法与化学发光免疫分析法有很好的一致性(y＝0.9999x+0.0229)，两组测量值的比较显示出良好的线性相关性(r2＝0.981)。当前第1页12