胰岛细胞抗体检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于免疫诊断
技术领域：
，具体涉及一种胰岛细胞抗体检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
ⅰ型糖尿病(t1dm)是易感个体胰岛β细胞自身免疫性损害所致,呈现胰岛素(ins)分泌逐渐减少或缺乏。胰岛细胞抗体(ica)是t1dm患者体液免疫异常时可在血清中检测到的抗体之一,是缓慢进展的β细胞损伤的血清学标志。胰岛由多种内分泌细胞组成,β细胞分布于胰岛中央,分泌胰岛素,位于胰岛周边的α细胞也参与胰岛素分泌的调控。icas按其与胰岛细胞结合的部位可分为胰岛细胞胞浆抗体(ica)与胰岛细胞表面抗体(icsa)两类。ica阳性提示β细胞出现自身免疫损害,因此是t1dm的预测指标。胰岛细胞抗体(ica)作为一类自身抗体,发现于1974年,当时认为与胰岛的所有细胞均存在反应。1型糖尿病的儿童中,70％～80％在明确诊断时ica为阳性。在成年发病的糖尿病人群中,2型糖尿病占绝大多数,但约有10％～25％具有2型糖尿病临床表型的患者在诊断糖尿病时被证实存在胰岛的自身免疫反应。ica是这些患者体内存在的标志性抗体。这其中包括一部分成人隐匿性自身免疫性糖尿病(lada)患者。但这部分病人的临床表现也各有不同。现公认icas对iddm易感个体的鉴定、iddm发生与发展的监测、糖尿病分型及早期iddm的免疫抑制治疗及胰腺或胰岛移植的适宜时间的选择及移植后移植物功能存活的监测等均有重要的价值。目前ica的测定,但方法不尽相同,有免疫荧光、免疫组化及酶联免疫吸附法(elisa)三大类。主要检测方法有间接免疫荧光(if)、酶标法、免疫组化技术、elisa方法，但实际应用中都均存在一些固有缺陷,其中，if法荧光易猝灭,切片背景不清晰,不能长期保存,定位困难,而且有造成判断上的困难等缺点；酶标法的免疫组化技术操作比较复杂,且o型血人胰腺来源较为困难；elisa方法对ica抗体进行检测,准确性及重复性不稳定,尚需进一步验证。技术实现要素：本发明的目的是为了解决现有的ica的检测方法准确性及重复性不稳定的问题，而提供一种胰岛细胞抗体检测试剂盒及其制备方法。为达到以上目的，本发明提供以下技术方案：本发明首先提供一种胰岛细胞抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：校准品、链霉亲和素磁颗粒悬浮液、化学发光标记物标记的抗人igg抗体和偶联标记的胰岛细胞抗原。优选的是，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒的质量分数是0.007％～0.1％。优选的是，所述的链霉亲和素磁颗粒悬浮液中，链霉亲和素磁颗粒的粒径为0.05～1μm。优选的是，所述化学发光标记物标记的抗人igg中，抗人igg为鼠抗人igg或羊抗人igg。优选的是，所述的化学发光标记物标记的抗人igg中，抗人igg抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:3～20。优选的是，所述化学发光标记物为吖啶酯和三联吡啶钌。优选的是，所述偶联标记的胰岛细胞抗原中，胰岛细胞抗原与偶联标记物的摩尔比为1:5～20。优选的是，所述偶联标记物为生物素。优选的是，所述的试剂盒还包括化学发光预激发液a、化学发光激发液b及清洗液，所述化学发光激发液a为硝酸溶液，化学发光激发液b为氢氧化钠溶液；清洗液为pb。本发明还提供一种胰岛细胞抗体检测试剂盒的制备方法，包括：步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备将链霉亲和素磁颗粒溶液和tbst溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；步骤二：化学发光标记物标记的抗人igg抗体的制备将抗人igg放入离心管中离心，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，将封闭好的抗体经过纯化、收集，然后放入缓冲液中稀释，保存；步骤三：偶联标记的胰岛细胞抗原的制备取胰岛细胞抗原，ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，2～8℃反应1～3h，再转入室温继续反应10～30min，最后加入赖氨酸反应10～30min，经纯化，加入等体积甘油和nan3或proclin300，得到偶联标记的胰岛细胞抗原。本发明有益效果(1)采用本方法制备的试剂盒具有较高的检测灵敏度，操作简单、定量检测准确、快速，从检测到出结果只需20分钟；(2)采用顺磁性的微粒作为固相载体，其比表面积大，提高了检测的灵敏度；(3)采用本方法制备的试剂盒与样品所形成的抗原抗体复合物，稳定性佳，且分别由吖啶酯标记的抗人igg及生物素标记的胰岛细胞抗原进行检测，不仅增加了发光率同时扩大了大了反应级，大大提高了试剂的特异性及检测速度；(4)采用本方法制备的试剂盒可直接用于全自动生化分析仪上，无需大型仪器设备配合，成本低，且无放射性污染，可大规模的开展和推广。(5)本发明的检测试剂盒为化学发光免疫分析法，该方法具有种操作简单，无放射性风险及其检测时间短，并且可以对抗原、抗体类目标物质进行检测；另一方面，胰岛细胞抗体化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。附图说明图1是本发明胰岛细胞抗体检测试剂盒剂反应校准曲线。具体实施方式为了使本发明的优点、目的和方法更加详实易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了诸多细节以便于理解，但本发明可以以不同与描述的其他方式来实施。本发明首先提供一种胰岛细胞抗体检测试剂盒，该试剂盒包括：校准品、链霉亲和素磁颗粒悬浮液、化学发光标记物标记的抗人igg抗体和偶联标记的胰岛细胞抗原。按照本发明，所述的试剂盒中，链霉亲和素磁颗粒的质量分数优选是0.007％～0.1％。按照本发明，所述的链霉亲和素磁颗粒悬浮液中，链霉亲和素磁颗粒的粒径优选为0.05～1μm。当链霉亲和素磁颗粒的粒径低于0.05μm时，抗原或者抗体与磁珠结合率低，可能导致整体光量子数偏低；当链霉亲和素磁颗粒的粒径高于1μm时，非特异性结合效果明显，可能导致试剂盒灵敏度差等。按照本发明，所述化学发光标记物标记的抗人igg中，抗人igg为鼠抗人igg或羊抗人igg，抗人igg抗体与化学发光标记物的摩尔比优选为1:3～20；所述化学发光标记物优选为吖啶酯和三联吡啶钌，更优选为吖啶酯。按照本发明，所述偶联标记的胰岛细胞抗原中，胰岛细胞抗原与偶联标记物的摩尔比优选为1:5～20；所述偶联标记物优选为生物素。按照本发明，所述的试剂盒还包括化学发光预激发液a、化学发光激发液b及清洗液，所述化学发光激发液a为硝酸溶液，化学发光激发液b为氢氧化钠溶液；清洗液为pb。按照本发明，所述校准品的浓度分别为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的胰岛细胞抗体溶液。本发明还提供一种胰岛细胞抗体检测试剂盒的制备方法，包括：步骤一：链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备将链霉亲和素磁颗粒溶液和tbst溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成固相试剂，得到链霉亲和素磁颗粒悬浮液；所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50～100mg/ml；链霉亲和素磁颗粒溶液和tbst溶液的体积比优选为(0.5～1)：(5～10)；所述的混匀时间优选为10-15分钟，所述的缓冲液为50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5；所述的固相试剂的浓度优选为0.01％～1％；所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的来源为商购，选自安捷伦科技有限公司公司，货号pl6727-1001。步骤二：化学发光标记物标记的抗人igg抗体的制备将抗人igg放入离心管中离心，优选在室温下离心10s～30s，保证抗体位于离心管底部位置，然后加入碳酸缓冲液，混匀后加入化学发光标记物溶液离心，所述的离心温度优选为室温，离心时间优选为0.5min～3min；将离心管密封后放入避光暗盒中，然后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中混匀，所述的混匀时间优选为2-4h，加入封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀封闭，所述的封闭时间优选为1-2h，将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶g250柱纯化、用pb缓冲液洗脱，收集，然后放入缓冲液中稀释，保存；所述的抗人igg的质量(μg)：化学发光标记物溶液的体积(μl)优选为500：5；所述的化学发光标记物溶液的浓度优选为2mg/ml；所述的封闭液优选为赖氨酸，质量分数优选为20％；所述的缓冲液为50mmmes、0.05％吐温-20、0.05％proclin300，ph6.5；步骤三：偶联标记的胰岛细胞抗原的制备取胰岛细胞抗原，ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)，2～8℃反应1～3h，再转入室温继续反应10～30min，最后加入赖氨酸反应10～30min，经纯化，加入等体积甘油和nan3或proclin300，得到偶联标记的胰岛细胞抗原；所述的胰岛细胞抗原、已活化的长链磺化生物素和赖氨酸的摩尔比优选为1：(5-20)：100，所述的胰岛细胞抗原的浓度优选为0.5～10ug/ml。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述。实施例1本发明所述的胰岛细胞抗体的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，加入10ml的tbst溶液充分混匀10分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的固相试剂，2～8℃保存。(2)吖啶酯标记的抗人igg抗体的制备将500ug抗人igg放入离心管中，保证抗人igg位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μl2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心0.5分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀4小时。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗人igg上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗人igg溶液放置于2～8℃保存。使用时将纯化后的抗人igg浓溶液用50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2～8℃保存。(3)生物素标记的胰岛细胞抗原的制备取1mol0.5ug/ml胰岛细胞抗原，ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入5倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)，2～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300。所述化学发光激发液a为硝酸溶液，b为氢氧化钠溶液；清洗液为pb。所述校准品可通过以下方法制备得到：①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，ph值6.5，2-8℃存放备用；②取一定量的胰岛细胞抗体用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的校准品，等量分装成浓度分别为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的6瓶校准品。实施例2本发明所述的胰岛细胞抗体的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，加入10ml的tbst溶液充分混匀15分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的固相试剂，2～8℃保存。(2)吖啶酯标记的抗人igg抗体的制备将500ug抗人igg放入离心管中，保证抗人igg位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μl2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心3分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀2小时。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为2h。将封闭好的抗人igg上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗人igg溶液放置于2～8℃保存。使用时将纯化后的抗人igg浓溶液用50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2～8℃保存。(3)生物素标记的胰岛细胞抗原的制备取1mol10ug/ml胰岛细胞抗原，ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入10倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)，2～8℃反应3h，再转入室温继续反应20min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应20min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300。所述化学发光激发液a为硝酸溶液，b为氢氧化钠溶液；清洗液为pb。所述校准品可通过以下方法制备得到：①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，ph值6.5，2-8℃存放备用；②取一定量的胰岛细胞抗体用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的校准品，等量分装成浓度分别为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的6瓶校准品。实施例3本发明所述的胰岛细胞抗体的化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：(1)链霉亲和素磁颗粒悬浮液的制备取浓度是100mg/ml的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5毫升(50mg)，加入10ml的tbst溶液充分混匀10分钟后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒。重复清洗3次后在50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液中配成磁珠浓度为0.05％的固相试剂，2～8℃保存。(2)吖啶酯标记的抗人igg抗体的制备将500ug抗人igg放入离心管中，保证抗人igg位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μl2mg/ml吖啶酯的dmf溶液，用离心机室温条件下离心2分钟。将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)，混匀3小时。加入1ml20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗人igg上葡聚糖凝胶g250柱纯化，用pb缓冲液洗脱，分部收集。将收集好的抗人igg溶液放置于2～8℃保存。使用时将纯化后的抗人igg浓溶液用50mmmes、0.05％吐温、0.05％proclin300，ph6.5的缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/ml，2～8℃保存。(3)生物素标记的胰岛细胞抗原的制备取1mol5ug/ml胰岛细胞抗原，ph6.5的tris缓冲液透析纯化后加入20倍摩尔比已活化的长链磺化生物素(sulfo-nhs-lc-biotin)，2～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入等体积甘油和0.1％nan3或0.1％proclin300。所述化学发光激发液a为硝酸溶液，b为氢氧化钠溶液；清洗液为pb。所述校准品可通过以下方法制备得到：①校准品缓冲液的组成：由0.1mol/l的pb、0.15mol/l的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％的tween-20组成，ph值6.5，2-8℃存放备用；②取一定量的胰岛细胞抗体用①步所得校准品缓冲液分别配制成浓度为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的校准品，等量分装成浓度分别为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml的6瓶校准品。实施例4本发明所述的甲状旁腺素的化学发光免疫检测试剂盒的检测步骤如下：以全自动化学发光免疫分析仪(cm180)为检测工具，方法学模式为间接法，即仪器依次加入10μl的样本，50μl生物素标记的胰岛细胞抗原，50μl吖啶酯标记的鼠抗人igg,及40μl链霉亲和素磁颗粒。反应20分钟后，进行磁分离。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光底物液a液(hno3溶液)和b液(naoh溶液)进行反应，最后记录光量子数。实施例5胰岛细胞抗体的化学发光免疫检测试剂盒性能评价1、灵敏度的检测：参照参考文件实验方案，主校准品a为零浓度校准品，主校准品b为相邻校准品；测试主校准品a，重复20次；测试主校准品b，重复2次；计算胰岛细胞抗体化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度应小于0.04u/ml。本发明结灵敏度最低检测线为0.0380u/ml，即线性检测合格，数据如表1所示：表12、线性的检测：将校准品浓度为0u/ml，10u/ml、50u/ml、100u/ml、200u/ml、350u/ml作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.998，线性范围为3-350u/ml。如表2所示，图1是本发明胰岛细胞抗体检测试剂盒剂反应校准曲线；即校准曲线方程为：y＝548.8x-1685，r2＝0.998，相关系数r>0.998。表23、抗干扰特异性实验：在胆红素20mg/dl(342μmol/l)、血红蛋白500mg/dl(5g/l)、甘油三酯(三酸甘油脂)50000mg/dl(56.44mmol/l)、人血清白蛋白49g/l的样本，不会显著影响甲状旁腺素的测定(±10％)，结果如表3所示：表3抗干扰特异性实验结果潜在干扰物质浓度平均回收率(％)胆红素20mg/dl103血红蛋白500mg/dl97甘油三酯50000mg/dl105人血清白蛋白49g/l98.2当前第1页12