一种HPLC法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法与流程

本发明涉及酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的检测领域，尤其涉及一种hplc法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法。

背景技术

心宝丸主要由蟾酥、洋金花、附子、三七、人参、鹿茸、肉桂、麝香、冰片九味药材精制而成，具有温补心肾，益气助阳，活血通脉等效用，临床用于治疗心肾阳虚，心脉瘀阻引起的慢性心功能不全：窦房结功能不全引起的心动过缓、病窦综合症及缺血性心脏病引起的心绞痛及心电图缺血性改变。其中蟾酥药味为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的干燥分泌物，现代药理研究表明，蟾蜍甾烯类物质华蟾酥毒基和脂蟾毒配基小剂量时表现出强心苷样作用，大剂量时具有明显的心脏毒性。

2015版《中华人民共和国药典》中采用高效液相色谱法测定蟾酥中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量，并规定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量不少于6.0％，具体色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(50:50)(用磷酸调节ph值为3.2)为流动相，检测波长为296nm，柱温为40℃。理论塔板数按华蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰计算应分别不低于4000。现有文献报道中，仅有广东省药物研究所张电光采用hplc法测定心宝丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，具体色谱条件为:依利特agilenthc-c18(5um,4.6mm×250mm)色谱柱，流动相：乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(40:60)(用磷酸调节ph至3.2)，流速1ml/min，柱温35℃，检测波长296nm，进样量20ul。而心宝丸目前执行的标准为《卫生部药品标准中药成方制剂第十八册》(标准编号：ws3-b-3379-98)，标准中缺少含量测定项。由于华蟾酥毒基和脂蟾毒配基化学结构类似，极性相近，目前的色谱条件不能达到华蟾酥毒基成分峰和脂蟾毒配基成分峰完全分离的效果，故现在的技术水平无法准确的测定心宝丸中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基成分的真实含量，无法达到分别准确控制两种成分的目的，因此不能有效控制产品质量，存在一定的缺陷性。目前无论是中国药典，还是张电光检测心宝丸中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基含量均采用乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液系统作为液相色谱方法条件，得出的色谱图中脂蟾毒配基和华蟾酥毒基两个主要成分色谱峰分离度较小，未完全分离，导致不适合单独检测脂蟾毒配基、华蟾酥毒基的含量；而且上述检测方法的色谱条件均采用了缓冲盐系统、而且柱温较高，不利于色谱柱的长期使用，对色谱柱损伤较大；样品前处理过程繁琐复杂，易造成待测成分的损失。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种hplc法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法，该方法能够完全分离心宝丸中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基，而且分离度大于2.0，能够分别计算华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量，同时峰型对称，拖尾因子位于0.95-1.05之间。

本发明的目的采用以下技术方案实现：

一种hplc法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备对照品溶液的步骤：取酯蟾毒配基对照品和华蟾酥毒基对照品适量，加甲醇稀释，即得对照品溶液；

制备供试品溶液的步骤：称取一定量的心宝丸供试品，研细，加甲醇稀释，称重，加热回流0.5-3h，放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，过滤，续滤液即为供试品溶液；

确定色谱条件的步骤：色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水、乙腈和甲醇为流动相；流速：0.5-3ml/min，柱温15-30℃，检测波长280-300nm，进样量为10-30ul；

检测的步骤：采用hplc法对供试品溶液和对照品溶液进行检测。

进一步地，所述对照品溶液每1ml含华蟾酥毒基对照品和酯蟾毒配基对照品各30ug。

进一步地，所述制备对照品溶液的步骤中，酯蟾毒配基对照品和华蟾酥毒基对照品在稀释前，先用五氧化二磷减压干燥24h。

进一步地，所述制备供试品溶液的步骤中，加热回流的时间为1小时；用微孔滤膜进行过滤。

进一步地，所述确定色谱条件的步骤中，理论塔板数按华蟾酥毒基和酯蟾毒配基峰计算应分别不低于4000。

进一步地，所述确定色谱条件的步骤中，水、乙腈和甲醇的比例为45:10:45。

进一步地，所述确定色谱条件的步骤中，流速为1ml/min，柱温为25℃，检测波长为296nm，进样量为20ul。

进一步地，所述检测的步骤是在岛津lc-20at高效液相色谱仪上进行。

进一步地，所述确定色谱条件的步骤中，色谱柱为phenomenex5μmc18(2)色谱柱。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明的色谱条件采用甲醇-乙腈-水系统为流动相，条件温和，有利于色谱柱的长期使用，延长色谱柱的使用寿命；而且柱温采用25℃的室温，相比现有技术中的40℃和35℃柱温，更有利于温度的稳定控制，进一步有利于延长色谱柱的使用寿命。

2.本发明的检测心宝丸中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的方法，样品前处理简单方便、步骤少、易操作、待测成分不容易损失。

3.本发明的hplc法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法，能够分离心宝丸中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基，而且分离度大于2.0，能够实现完全分离，而且能够分别检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量，达到准确控制这两种毒性成分的目的，利于控制心宝丸的产品质量。

附图说明

图1、为实施例1中对照品1-1的图谱；

图2、为实施例1中对照品1-2的图谱；

图3、为实施例1中对照品2-1的图谱；

图4、为实施例1中对照品2-2的图谱；

图5、为实施例1中供试品溶液a1的图谱；

图6、为实施例1中供试品溶液a2的图谱；

图7、为实施例1中供试品溶液b1的图谱；

图8、为实施例1中供试品溶液b2的图谱；

图9、为实施例1中供试品溶液c1的图谱；

图10、为实施例1中供试品溶液c2的图谱；

图11、为实施例1中供试品溶液d1的图谱；

图12、为实施例1中供试品溶液d2的图谱；

图13、为实施例1中供试品溶液e1的图谱；

图14、为实施例1中供试品溶液e2的图谱；

图15、为实施例1中供试品溶液f1的图谱；

图16、为实施例1中供试品溶液f1的图谱；

图17、流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(50：50)时，检测华蟾酥毒基对照品的色谱图；

图18、流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(50：50)时，检测酯蟾毒配基对照品的色谱图；

图19、流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(50：50)时，检测心宝丸供试品的色谱图；

图20、流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(40：60)时，检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品的色谱图；

图21、流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(45：55)时，检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品的色谱图；

图22、流动相为水-甲醇(40：60)时，检测心宝丸供试品的色谱图；

图23、流动相为水-乙腈(60：40)，检测心宝丸供试品的色谱图；

图24、流动相为水-乙腈-甲醇(40：55：5)，检测心宝丸供试品的色谱图；

图25、流动相为水-乙腈-甲醇(42：55：3)，检测心宝丸供试品的色谱图；

图26、流动相为水-乙腈-甲醇(45：50：5)，检测心宝丸供试品的色谱图；

图27、流动相为水-乙腈-甲醇(50：45：5)，检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基混合对照品的色谱图；

图28、流动相为水-乙腈-甲醇(50：40：10)，检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基混合对照品的色谱图；

图29、流动相为水-乙腈-甲醇(45：5：50)，检测心宝丸供试品的色谱图；

图30、流动相为水-乙腈-甲醇(45：10：45)，检测心宝丸供试品的色谱图。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：

一种hplc法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备对照品溶液的步骤：分别精密称取经五氧化二磷减压干燥24h的华蟾酥毒基对照品、酯蟾毒配基对照品适量，加甲醇稀释成每1ml含华蟾酥毒基对照品和酯蟾毒配基对照品各30ug的溶液，摇匀，滤过，即得对照品溶液；

制备供试品溶液的步骤：取心宝丸供试品适量，研细，精密称定细粉5.5g，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，用微孔滤膜过滤，摇匀，所得续滤液即为供试品溶液；

确定色谱条件的步骤：色谱柱采用phenomenex5μmc18(2)色谱柱；以水、乙腈和甲醇为流动相，水、乙腈和甲醇的比例为45:10:45；流速为1ml/min，柱温为25℃，检测波长为296nm，进样量为20ul；理论塔板数按华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰计算应分别不低于4000。

检测的步骤：在岛津lc-20at高效液相色谱仪上，采用hplc法对供试品溶液和对照品溶液进行检测。

验证实施例：

1验证实施例1：

1.1验证实施例1的检测方法：

按照实施例1的制备对照品溶液的步骤，制备两份对照品溶液，分别为对照品1和对照品2；将这两份对照品溶液分别平分为两份，制得平行双样，即对照品1-1、对照品1-2和对照品2-1、对照品2-2。

按照实施例1的制备供试品溶液的步骤，制备六份供试品溶液，分别为a、b、c、d、e和f,将上述六份供试品溶液分别平分为两份，制得平行双样，即供试品a1、a2、b1、b2、c1、c2、d1、d2、e1、e2、f1和f2，共12份；

按照实施例1的色谱条件，在岛津lc-20at高效液相色谱仪上对上述对照品和供试品进行测定；

试验结果的图谱参见附图1-16。

1.2方法学验证

1.2.1专属性验证：

阴性供试品溶液的制备：取心宝丸阴性供试品(不含华蟾酥毒基、酯蟾毒配基)，按照实施例1制作供试品溶液的方法制得阴性供试品溶液。对照品、供试品溶液和色谱条件、检测方法同实施例1。

1.2.1.1验证结果：供试品溶液的色谱中，在对照品色谱相应的出峰时间有色谱峰出现，供试品溶液中主要成分色谱峰与邻峰的分离度大于1.5，峰形基本对称；阴性供试品无干扰。

1.2.2线形验证：

对照品溶液的制备：分别精密称取华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量,加甲醇使溶解并制成表1中的线性浓度对照品混合溶液：

表1

供试品、色谱条件同实施例1；并参照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)进行测定；以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线得回归方程。

1.2.2.1验证结果：华蟾酥毒基在浓度10-50ug/ml范围内、酯蟾毒配基在浓度10-50ug/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系(r2≥0.9990)。

1.2.3稳定性验证：

参照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)进行测定；分别在0小时、8小时、16小时、24小时、36小时、48小时进行测定；记录色谱图中实施例1的对照品溶液、供试品溶液的中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基峰面积，并计算峰面积的rsd值。

1.2.3.1验证结果：华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的峰面积的相对标准偏差均不大于4.0％。

1.2.4精密度验证：

参照高效液相色谱法((《中国药典》2015年版四部通则0512)进行测定；测定实施例1的供试品峰面积与对照品峰面积，计算，记录色谱图，并计算供试品含量结果的rsd。

1.2.4.1验证结果：供试品中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的含量的相对标准偏差不大于8.0％。

1.2.5准确度验证

参照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)进行测定；测定实施例1的供试品峰面积与对照品峰面积，计算，记录色谱图，并按下面的公式计算各主成分的回收率：

酯蟾毒配基回收率(％)＝(测得酯蟾毒配基总量-供试品原含酯蟾毒配基的量)/加入酯蟾毒配基对照品的量×100％；

华蟾酥毒基回收率(％)＝(测得华蟾酥毒基总量-供试品原含华蟾酥毒基的量)/加入华蟾酥毒基对照品的量×100％。

1.2.5.1验证结果：回收率在85.0％-110.0％之间，且相对标准偏差不大于4.0％。

2.验证色谱条件：

2.1色谱条件为：乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph至3.2)(50：50)，流速、柱温、检测波长、进样量同实施例1，检测华蟾酥毒基对照品，测试的色谱图参见图17。

2.2色谱条件为：乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph至3.2)(50：50)，流速、柱温、检测波长、进样量同实施例1，检测酯蟾毒配基对照品，测试的色谱图参见图18。

2.3色谱条件为：乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph至3.2)(50：50)，流速、柱温、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，测试的色谱图参见图19。

2.4色谱条件为：乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph至3.2)，梯度洗脱，梯度比例设置为：0-15min,乙腈-0.5％磷酸二氢钾(40：60)；15-16min,乙腈40-20，0.5％磷酸二氢钾60-80；16-40min，乙腈20-60，0.5％磷酸二氢钾80-40，流速、柱温、检测波长、进样量同实施例1，测试华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品，对照品的制备方法同实施例1，测试的色谱图参见图20。

2.5色谱条件为：乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节ph至3.2),梯度洗脱，比例设置为0-15min,乙腈-0.5％磷酸二氢钾(45：55)；15-16min,乙腈45-20，0.5％磷酸二氢钾55-80；16-40min，乙腈20-60，0.5％磷酸二氢钾80-40，流速、柱温、检测波长、进样量同实施例1，测试华蟾酥毒基和酯蟾毒配基对照品，对照品的制备方法同实施例1，测试的色谱图参见图21。

2.7色谱条件为：以水-甲醇(40：60)作为流动相,柱温30℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图22。

2.8色谱条件为：以水-乙腈(60：40)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图23。

2.9色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(40：55：5)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图24。

2.10色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(42：55：3)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图25。

2.11色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(45：50：5)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图26。

2.12色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(50：45：5)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基混合对照品，对照品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图27。

2.13色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(50：40：10)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测华蟾酥毒基和酯蟾毒配基混合对照品，对照品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图28。

2.14色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(45：5：50)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图29。

2.15色谱条件为：以水-乙腈-甲醇(45：10：45)作为流动相,柱温25℃,流速、检测波长、进样量同实施例1，检测心宝丸供试品，供试品溶液的制备方法同实施例1，色谱图见附图30。

综上，本发明的hplc法检测心宝丸中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的方法，在流动相为水、乙腈和甲醇时分离效果好，并且在水、乙腈和甲醇的比例为45：10：45时，能够达到完全分离，而且柱温为25℃，利于温度的稳定控制。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。