一种人肌钙蛋白I的超敏定量测定试剂盒及其检测方法与流程

本发明涉及临床检验领域，尤其是涉及一种测定人肌钙蛋白i(troponini)含量的试剂盒及其测试方法。

背景技术：

人肌钙蛋白由肌钙蛋白i、t、c三亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白atp酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。肌钙蛋白i(tni)是横纹肌的一种关键调节蛋白。尽管所有横纹肌tni的功能都相同，但心肌tni(ctni，分子质量23.9kd)与骨骼肌tni明显不同。

由于组织特异性高，心肌肌钙蛋白i(ctni)是心肌损伤的高敏感性标志物。ctni还可用于鉴别骨骼肌损伤(如横纹肌溶解、多发性损伤和非心脏手术)和心肌损伤。ctni已经明确是急性冠状动脉综合征(acs)患者的预后标志物，可以预测近期、中期甚至长期预后。

ctni和ctnt已确定是预测acs后果的最佳独立标志物。欧洲心脏病协会(esc)和美国心脏病学会(acc)联合对心肌梗死(mi)进行了重新定义。根据此定义，在临床急性缺血的情况下，当血中ctni水平高于参考范围(健康人群)99百分位值时，即可诊断为mi。同时要求肌钙蛋白检测方法的不精密度(变异系数)≤10％。根据以上规定，如果一种检测方法在cv小于10％的前提下，可以测量到99％分位或更低的数值，我们就可以称之为超敏肌钙蛋白。应用第99百分位数参考上限时，其临界值为0.02ng/ml，而在cv≤10％时，最低测量值至少应不大于0.015ng/ml。

根据mi的重新定义，已经发表了许多关于心肌肌钙蛋白检测在acs患者中的作用的建议。在uap和非st段抬高型心肌梗死(nstemi)患者中，检测到的心肌肌钙蛋白水平与高死亡率有关。因此，肌钙蛋白的检测对这些患者的危险分级非常有用，也是acc/aha(美国心脏病学会)对uap和nstemi患者处理导则的一部分。ctn具有相当长的诊断窗口期(ctni7至9天，ctnt更长)，因此很快检测出结果很重要。从检测角度上来说，目前临床上用于测定ctni的方法主要有放免法、胶体金免疫层析法、elisa法、化学发光法等。化学发光法检测时间短、灵敏度高、准确性高。

磁微粒酶促化学发光检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统elisa方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(elisa板反应孔)表面进行的。磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统elisa相比具有灵敏度高，检测用时少等优点。

技术实现要素：

因此，根据本申请的一方面，提供一种肌钙蛋白i的检测试剂盒，其包含：表面上结合有第一抗ctni单克隆抗体的磁微粒；表面上结合有第二抗ctni单克隆抗体的磁微粒；酶标记的第三抗ctni单克隆抗体；和/或酶标记的第四抗ctni单克隆抗体，其中所述第一、第二、第三和第四单克隆抗体分别特异于人肌钙蛋白i的不同表位。

在具体的实施方式中，第一和第二抗ctni单克隆抗体共价结合至磁微粒的表面。在具体的实施方式中，第一和第二抗ctni单克隆抗体可以结合到同一磁微粒上，也可以分别结合至不同的磁微粒上。在具体的实施方式中，第一和第二抗ctni单克隆抗体各自独立地包被到磁微粒上。

在一些具体的实施方式中，采用碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶来标记抗ctni单克隆抗体；优选采用碱性磷酸酶标记第三和第四抗ctni单克隆抗体。

在一些具体的实施方式中，本申请的试剂盒还包含碱性磷酸酶的底物、或者辣根过氧化物酶的底物。本领域技术人员公知的任何适当底物都是允许的；作为非限制性的实例，例如但不限于二氧杂环乙烷、二氧杂环乙烷类似物、鲁米诺、鲁米诺衍生物。

在一些实施方式中，本申请的试剂盒还包含洗涤液，所述洗涤液包含tris-hcl缓冲液和吐温80。优选地，洗涤液含有吐温80、nacl、proclin-300和tris-hcl缓冲液。在一些具体的实施方式中，所述吐温80的浓度为0.5g/l至2g/l。在优选的实施方式中，吐温80的浓度为0.8g/l至1g/l。

在一些实施方式中，第一抗ctni单克隆抗体在试剂中的浓度是3.2μg/ml；第二抗ctni单克隆抗体在试剂中的浓度是3.2μg/ml。

在一些实施方式中，第三抗ctni单克隆抗体在试剂中的浓度是1.6μg/ml；第四抗ctni单克隆抗体在试剂中的浓度是1.6μg/ml。

在一些实施方式中，磁颗粒的粒径是0.5至3.5μm；优选1至3μm。

在一些实施方式中，第一和第二抗ctni单克隆抗体位于相同的容器中。第三和第四抗ctni单克隆抗体位于相同的容器中。第一和第二抗ctni单克隆抗体与第三和第四抗ctni单克隆抗体位于不同的容器中。

在具体的实施方式中，本申请的试剂盒包含或者由如下组成：(a)磁分离试剂、(b)酶标记试剂和(c)底物；其中磁分离试剂包含表面上结合有第一抗ctni单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗ctni单克隆抗体的磁微粒；所述酶标记试剂包含酶标记的第三抗ctni单克隆抗体和酶标记的第四抗ctni单克隆抗体；所述底物包含鲁米诺或其衍生物。

另一方面，本申请提供一种改善肌钙蛋白i的检测灵敏度的方法，其包括如下步骤：(a)将表面上结合有第一抗ctni单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗ctni单克隆抗体的磁微粒混合；以及(b)将酶标记的第三抗ctni单克隆抗体和酶标记的第四抗ctni单克隆抗体混合；以及任选地(c)将上述步骤所得的混合物和待测样本接触；其中所述第一、第二、第三和第四单克隆抗体分别特异于人肌钙蛋白i的不同表位；步骤(a)和步骤(b)顺序是可互换的。

在具体的实施方式中，表面上结合有第一抗ctni单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗ctni单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1进行混合。结合有第三抗ctni单克隆抗体的磁微粒和所述表面上结合有第四抗ctni单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1进行混合。

又一方面，本申请提供一种制备本申请所述检测试剂盒的方法，其包括如下步骤：将表面上结合有第一抗人肌钙蛋白i单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗人肌钙蛋白i单克隆抗体的磁微粒混合；以及将酶标记的第三抗人肌钙蛋白i单克隆抗体和酶标记的第四抗人肌钙蛋白i单克隆抗体混合，其中所述第一、第二、第三和第四单克隆抗体分别特异于人肌钙蛋白i的不同表位。在具体的实施方式中，表面上结合有第一抗ctni单克隆抗体的磁微粒和表面上结合有第二抗ctni单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1进行混合。结合有第三抗ctni单克隆抗体的磁微粒和所述表面上结合有第四抗ctni单克隆抗体的磁微粒，按照质量比1:1进行混合。

附图说明

图1：本申请试剂盒和对比试剂的相关性(横纵坐标的单位为ng/ml，横坐标为对比试剂的测值，纵坐标为本申请试剂盒测值)。

具体实施方式

实施例

实施例1.磁分离试剂的制备过程

一、试剂的配制操作步骤：

1、结合缓冲液：

称取21.32gmes加约800ml纯水使之溶解，过后用naoh调ph至5.0，定容至1l。

2、清洗液：

称取tris3.025g、nacl9g加约800ml纯水使之溶解，过后用hcl调ph至7.2后，加入0.5gtween-20混匀后，定容至1l。

3、交联试剂：

含10mg/mledc的冰冷结合缓冲液，临用现配。

4、封闭液：

biolipidure-203或-206。

5、储存液：

称取tris0.605g、nacl0.9g加约80ml纯水使之溶解，过后用hcl调ph至7.2后，加入0.1gbsa、0.1gtween-20混匀后，定容至100ml。

二、磁分离试剂的制备过程

1、将磁颗粒em1-100140(merck，粒径0.93μm，也允许使用其它市售等同磁颗粒，如thermo的产品)重悬后取1ml于15ml离心管中。

2、置于磁力架上磁分离1min后小心移走上清。

3、加入10ml结合缓冲液充分重悬磁颗粒后，置于磁力架上磁分离1min后小心移走上清，此步重复三次。

4、加入10ml结合缓冲液充分重悬磁颗粒后，加入1ml交联试剂混匀，室温避光混匀反应30min。

5、置于磁力架上磁分离1min后小心移走上清。

6、加入10ml结合缓冲液清洗一次，置于磁力架上磁分离1min后小心移走上清，加入10ml结合缓冲液后加入1.5mg第一抗ctni单克隆抗体(购自hytest，货号916)混匀，室温避光混匀反应3h。

7、加入10ml清洗液清洗磁颗粒3次，最后一次移走上清后加入5ml封闭液混匀，室温避光混匀反应过夜。

8、加入10ml清洗液清洗三次。

9、加入10ml储存液混匀后4℃储存。

第二抗ctni单克隆抗体(购自hytest，货号3c7)按照上述步骤1至9进行同样包被。

实施例2.酶标记抗体制备过程

一、试剂的配置步骤：

1、0.1mpbsph7.4：

称取kh2po42.4g、na2hpo414.4g、nacl8g、kcl0.2g加800ml纯水溶解后，调ph至7.4，定容至1l。

2、储存液：

称取tris0.605g加约80ml纯水使之溶解，过后用hcl调ph至7.4后加入2gbsa、0.02gmgcl2和0.02gnan3，混匀后定容至100ml。

二、酶标记抗体步骤；

1、取2mg第三抗ctni单克隆抗体(购自hytest，货号560)与2mg碱性磷酸酶分别小心加到透析袋中，在0.1mpbsph7.4中透析2h。

2、取出透析好的抗体与碱性磷酸酶至于离心管中，缓慢加入0.2ml0.1％戊二醛，室温避光反应2h。

3、缓慢加入0.1ml乙醇胺，室温避光反应1h。

第四抗ctni单克隆抗体(购自hytest，货号mf4)按照上述步骤1至3进行同样的标记。

三、酶标记抗体纯化步骤；

1、脱盐：

以20mmpbs为洗脱液，流速5ml/min，5ml脱盐柱，上样速度2ml/min；首先用20mmpbs冲洗系统30min，上样并收集。此步操作目的在于去除多余的戊二醛和乙醇胺。

2、纯化：

以20mmpbs为流动相，流速0.5ml/min，tsk3000的hplc预装柱；首先将抗ctni单克隆抗体与碱性磷酸酶分别上样，记录抗体与碱性磷酸酶的出峰时间；之后将碱性磷酸标记的抗体上样；根据出峰时间判断未结合的抗体与碱性磷酸酶的峰位置，剩下的峰面积较大的则为碱性磷酸酶标记的抗体；记录好每个组分的出峰时间，最后将碱性磷酸酶标记的抗体上样，根据之前的出峰时间收集样本；每一个峰收集在一个离心管内。将每个收集的组分超滤浓缩后加到储存液中，4℃保存。

实施例3.稀释液配置

此稀释液为抗体稀释液，用来将抗体稀释到使用浓度。

称取hepes11.9g、牛血清白蛋白7.0g、吐温803.3g、nacl9g、hbr1g、山羊血清5ml、鼠免疫球蛋白g0.5g、nan31g于1l烧杯中；加入500ml纯化水使之完全溶解；小心加入0.5mlpc300；全部完全溶解后定容至1l。

实施例4.洗涤液配置步骤：

称取tris6.057g于1l烧杯中，加入800ml纯化水使之完全溶解，用盐酸将ph调至7.2，加入nacl6g、tween-801g、nan31g使之完全溶解后定容至1l。

测试例1.灵敏度：

1、取50μl抗ctni单克隆抗体标准品(购自fitzgerald，货号30-1362)和待测样本(血清)加入对应的反应杯底部。

2、各取40μl包被有第一抗体的磁分离试剂和第二抗体的磁分离试剂到每一个反应杯中。

3、各取40μl包被有第三抗体的酶标记试剂和第四抗体的酶标记试剂到每一个反应杯中。

4、轻轻将加入的试剂混匀，37℃温浴15min。

5、试管置于磁分离器，磁分离。加入300μl洗涤液，磁分离，重复清洗分离5次。

6、准确加入100μl碱性磷酸酶底物至试管中混匀40秒，放入发光检测仪进行检测。

灵敏度结果：

将零点同时重复20次，取其平均值为924，加2sd与标准曲线相对比计算出结果为0.015ng/ml。

测试例2.相关性

1、对比试剂：

对比试剂为已经由药品监管部门批准上市的成熟试剂盒。其反应原理为夹心法。对比试剂的试剂盒组成：试剂1为包被抗体的磁性颗粒，试剂2为吖啶酯标记抗体。

2、比较方法：

本申请的试剂盒与对比试剂盒的检测原理是一致的；采用医院收集的血清总共83份进行平行测试；标准品如测试例1中所述。

3、实验结果：

表1.本申请试剂盒与对比试剂的测值(单位是ng/ml)

本申请试剂盒和已上市对比实际的相关性表示为：y＝0.9425x+0.1058，r²＝0.9897。这表明，本申请的试剂盒和市售产品具有良好的相关性(图1)。

然而，从上述数据也不难看出，对比试剂的测试结果中部分血清测值偏低很多，有的甚至出现患者被诊断为健康人，存在漏检问题。

测试例3.两种抗体和四种抗体所制备的试剂盒的比较

仅仅采用两种抗体(本申请上述4个抗体中的任意2个，以第一抗体和第三抗体为例)，按照上述同样方法制备成试剂盒，和本申请包含4个抗体的试剂盒进行比较。比较数据如下：

表2.两种抗体和四种抗体所制备的试剂盒的比较(单位是ng/ml)

从上述数据不难看出，当仅仅采用两种抗体制备试剂盒时，所获得的部分血清测值偏低，有的甚至出现患者被判断为健康个体，存在漏检问题。上述数据说明，采用四种抗体制备试剂盒能够显著改善漏检问题，大大降低了假阴性的出现。