测定水产品中的八种抗抑郁类药物残留的方法与流程

本发明涉及一种适用于水产品中的八种抗抑郁类药物残留的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法。

背景技术：

抑郁症是一类情感上的精神障碍疾病，其特征主要表现为自责、悲伤以及绝望等情绪异常，且经常伴有焦虑、睡眠质量不高及身体不适等典型症状，从而严重影响患病者的工作能力和生活质量，严重者甚至可能危及生命。

目前，抑郁症在临床上是一种很常见的精神类疾病，而随着人类社会生活节奏的加快，人们在精神和生活上的压力逐渐增大，使得抑郁症在全世界的发病率逐年上升。早在2001年，世界卫生组织(who)的健康报告中就已指出抑郁症是发达国家的主要发病类型之一，并预测到2020年，抑郁症会成为世界范围内的第二大疾病源，仅次于心脏病。目前对于抑郁症的治疗主要依靠服用不同种类的抗抑郁药来缓解抑郁症状，而由于当前抑郁症的全球普遍性，使得抗抑郁药的使用量逐年增加。抗抑郁药作为ppcps中重要的组成部分，已成为临床中使用较多的一类精神类药物。美国fda(foodanddrugadministration，食品药品监督管理局)最新公布的数据显示在美国rxlist(网上处方药物索引)中最受欢迎的10种药物基本都是精神类药物，其中包括两种抗抑郁药，西酞普兰和依地普仑。已有统计数据显示，目前全球销量最多的8种抗抑郁药分别为氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、氟伏沙明、文拉法辛、米氮平、度洛西汀和阿米替林，其总销售额超过全部抗抑郁药物销售总额的80％。

抗抑郁类药物与其它ppcps的迁移过程相同。环境中的ppcps的污染来源与人类活动密不可分。ppcps的污染源是生活污水、工业废水和医院废水等已处理水的排放；畜牧业、水产业、农业废水的直接排放或地下渗透；过期药品及化妆品的处理等。抗抑郁类药物在河水、饮用水、地下水中被广泛检测出，引起我们对其对人体健康影响的思考。研究表明，被药物污染的地表水，通过渗透作用进入地下水，人类长期饮用受污染的水体可能会引起内分泌干扰、生育率下降以及产生耐药性等。虽然部分研究对环境中的抗抑郁类药物对人体健康的危害尚不明确，但此类药物会在水产品体内的蓄积，而后通过食物链进入人体，其在水产品体内表现出的生理毒性会给人类健康带来一定风险。

目前，国内外尚无相关水产品中抗抑郁类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱检测方法的相关报道。水产品是人们日常饮食摄入的重要食品种类之一。我国是水产品生产大国，2012年我国的水产品总量达5907.68万吨，水产品产量连续多年居世界首位，水产品是我国打入国际市场的主要农产品品种之一。近年来，各级渔业主管部门紧紧围绕农业部提出的“努力确保不发生重大水产品质量安全事件”的目标任务，开展了大量卓有成效的工作，使我国水产品质量安全水平稳定向好。然而，伴随着渔业的快速发展，由于养殖环境不断恶化和养殖集约化程度不断提高，因药物残留问题引发的水产品质量安全事件时有发生面临日益严峻的水产品质量安全形势，如何准确地检测出水产品中药物残留状况并及时对其监管就显得至关重要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种简便、定性定量，灵敏度高的适用于水产品中八种抗抑郁类药物残留检测的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种测定水产品中的八种抗抑郁类药物残留的方法(即，水产品中八种抗抑郁类药物残留检测的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法)，包括以下步骤：

1)、制备待测样品溶液：

1.1、将待测样品均质：

以水产品作为待测样品，按照1g/5ml的料液比，在待测样品中加入0.10mol/lph6.0的磷酸盐缓冲溶液进行均质，得试样；

1.2、称取试样1～5g(较佳为2g)，精确至0.01g，置于容器(具塞离心管)内，精密加入预先零度低温保存的5～20ml(较佳为10ml)乙腈，漩涡振荡提取5～20min(较佳为15min)，加入2～10g(较佳为5g)氯化钠和5～10g(较佳为8g)无水硫酸钠，旋涡1～5min(较佳为2min)，以4000～8000r/min(较佳为5000r/min)的速度离心2～10min(较佳为5min)，精密吸取上清液(8ml)全部转移至10ml聚丙烯离心管中，待净化；

1.3、在步骤1.2所得的待净化样液中加入净化剂，旋涡1～5min(较佳为2min)混匀，以4000～8000r/min(较佳为5000r/min)的速度离心2～10min(较佳为5min)，

所述净化剂由500～2000mg(较佳为1500mg)无水硫酸钠，100～500mg(较佳为250mg)c18-n(十八烷基键合硅胶吸附剂)以及100～500mg(较佳为350mg)nh2-psa(nh2-丙基乙二胺吸附剂)组成；

1.4、精密取步骤1.3离心所得的上清液(5ml)于20～50℃(最佳为40℃)下氮吹至净干，精密加入0.5ml混合溶液(含0.1％(v/v)甲酸水溶液：甲醇＝65:35)，用0.20～0.45um过滤头过滤，得上清液；目的是供超高效液相色谱-串联质谱仪进行定性定量分析；

所述混合溶液由甲酸水溶液：甲醇＝65:35的体积比组成，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％。

2)、制备标准溶液

2.1、用色谱纯有机溶剂(甲醇或乙腈)分别将8种抗抑郁类药物标准物质(如表2所示)溶解，配置成浓度均为1000ug/ml的8种抗抑郁类药物标准储备溶液，于-20℃保存；

2.2、各取适量上述标准储备溶液用有机溶剂(甲醇或乙腈)配制成8种抗抑郁类药物的浓度均为100mg/l的混合标准储备溶液；

2.3、分别取检测结果为阴性的空白样品(与实际检测样品的基质一样，即，相同种类的水产品)8份，每份取2g，分别加入适量的混合标准储备溶液，按照1)待测溶液制备基质标准溶液，使得最终8份样品溶液中8种抗抑郁类药物浓度均分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ug/l，作为标准系列工作溶液；

3)、将标准系列工作溶液注入液质联用仪，确定8种抗抑郁类药物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程；

4)、取步骤1)(步骤1.4)所得的上清液按步骤3)方法测定上清液中各抗抑郁类药物峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各抗抑郁类药物的含量。

作文本发明的水产品中抗抑郁类药物残留的检测的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法的改进，所述8种残留的抗抑郁类药物为：氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、文拉法辛、阿米替林、氯丙咪嗪、曲米帕明。

作为本发明的水产品中抗抑郁类药物残留的检测的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法的改进：

所述的步骤3)的色谱条件(即超高效液相色谱(uplc)检测用的液相色谱条件)为：流速：0.3～0.8ml/min(较佳为0.5ml/min)；柱温：20～50℃(较佳为40℃)；进样量0.5～5μl(较佳为1μl)；

流动相由流动相a和流动相b组成：流动相：a(0.1％甲酸水溶液)：b(甲醇)＝65:35的体积比。上述％为体积％。备注：流动相比例不做变化，为等梯度。

即，流动相a为甲酸体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，流动相b为甲醇；流动相a：流动相b＝65:35的体积比。

作为本发明的水产品中抗抑郁类药物残留的检测的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法的进一步改进：所述液相色谱柱为：

所述步骤3)的质谱条件(即三重四级杆串联质谱(ms/ms)检测用的质谱条件)为：电喷雾离子源(esi)，正离子检测方式(esi+)；多反应检测(mrm模式)；干燥气温度：200℃；干燥气流速：14l/min；喷雾器压力：200kpa；毛细管电压：3.5kv；校准方法：质量轴自动调谐校正；mrm进行分段扫描：0～1.6min，文拉法辛；1.6～2.3min，西酞普兰；2.3～3.4min，帕罗西汀；3.4～4.3min，阿米替林；4.3～5.1min，氟西汀和曲米帕明；5.1～5.9min，舍曲林；5.9～7.0min，氯丙咪嗪；8种抗抑郁类药物的质谱分析参数如下：

表1、8种抗抑郁类药物质谱分析参数

注：*为定量离子对

作为本发明的水产品中抗抑郁类药物残留的检测的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法的进一步改进：所述有机溶剂均为色谱纯甲醇、乙腈。

表2、8抗抑郁类药物的化学信息表

现有的食品安全标准未曾有关于食品(包括水产品)中抗抑郁类药物残留的检测方法的研究，现有的文献也未曾有水产品中的抗抑郁类药物残留的检测方法的报导，本发明属于全新的检测方法的开发。

现有技术告知检验水产品药物残留过程中除去杂质(包括蛋白质、脂肪、色素等)采用通过有机溶剂(如正己烷等)来除去杂质，而本发明中发现采用如同本发明所述的分散固相萃取进行样品净化(步骤1.3所述净化剂)，能使本发明最终所得的样品溶液杂质更少，基质效应明显降低，提高了检验的准确性和精确性。

本发明与现有技术相比具有以下技术优势：

(1)本方法利用分散固相萃取净化技术，可以去除水产品中的蛋白质、脂肪等杂质，本方法相对其他固相萃取技术，消除了水产品复杂基质带来的基质效应，节省了检测时间，提高了检测准确度。

(2)本方法利用超高效液相色谱系统特有的超高压优势和实行核颗粒色谱技术(cortecs色谱柱)，优化了高效液相色谱仪运行背压，通过提高分离度以及峰容量实现了液相色谱仪分离效率的最大化，对目标化合物在提高分离度的同时获得更快的分析速度，两种色谱技术的结合，获得了更高的灵敏度，并大大缩短了分析时间，提高了分析效率。

(3)本发明公开的测定方法在1～50ug/l线性关系较好，线性相关系数为0.9955以上，方法最低检出限为0.04ug/kg。

综上所述，本发明所述分散固相萃取净化水产品中的杂质，前处理简单，杂质干扰和基质效应较小，回收率较好，重现性较高，本发明所述的超高效液相色谱-串联质谱法能在7分钟内就能快速准确的对8种抗抑郁类药物进行分离、定性定量分析，操作简单，灵敏度和准确度较好。

综上所述，本发明很好的解决了在检测水产品中抗抑郁类药物残留过程中的问题，为保障人类健康、提升企业自身技术发展水平、促进我国检测技术的发展，提升我国水产品质量安全检测技术在国际上的地位，增加就业，带动水产品产业的全面进步，为技术的进步、产业的转型升级都具有很大的经济社会效益，研究水产品中的八种抗抑郁类药物残留的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法具有重要的现实意义。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是8种抗抑郁类药物的总离子流图和定性定量离子对图。图中，a～h分别代表该8种抗抑郁类药物。

图中从左至右依次为总离子流图(tic)，文拉法辛、西酞普兰、帕罗西汀、阿米替林、曲米帕明、氟西汀、舍曲林、氯丙咪嗪的定性定量离子图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

1试剂和材料

除非另有说明，在分析中所用试剂均为色谱纯级，所有用水均为一级水。

1.1甲醇

1.2乙腈

1.3甲酸

1.4氯化钠：分析纯

1.5无水硫酸钠：分析纯

1.6十八烷基键合硅胶吸附剂(c18-n)

1.7nh2-丙基乙二胺吸附剂(nh2-psa)

1.8抗抑郁类药物标准物质：文拉法辛、西酞普兰、帕罗西汀、阿米替林、曲米帕明、氟西汀、舍曲林、氯丙咪嗪，纯度均≥99.0％。

1.9标准储备液：将上述8种抗抑郁类药物标准物质分别进行如下处理：用甲醇(或者其他合适有机溶剂)分别将8种抗抑郁类药物标准物质配置成标准储备溶液；再精密取适量上述标准储备溶液用甲醇(或者其他合适有机溶剂)配置成8种抗抑郁类药物的浓度均分别为0.1mg/l的混合标准储备溶液。

其他合适有机溶剂，例如为乙腈。

1.10标准工作液：将上述混合标准储备溶液用甲醇(或者其他合适有机溶剂)配制成浓度分布为0.2～50ug/l(例如具体为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ug/l)的混合标准工作溶液。

注：混合标准储备溶液在-20℃避光保存，有效期为一年。混合标准工作溶液在4℃下避光保存，有效期为3个月。

2仪器和设备

2.1超高效液相色谱仪(uplc)。

2.2三重四级杆串联质谱仪(ms/ms)。

2.3分析天平：感量为0.0001g与0.01g。

2.4漩涡振荡器。

2.5高速离心机：最大能到达到10000r/min。

2.6提取器：聚乙烯离心管，50ml。

2.7有机相过滤膜：0.22um。

实施例1、一种适用于水产品中8种抗抑郁类药物残留的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱法，依次进行以下步骤：

1)、制备待测样品溶液：

(1)取水产品作为待测样品，按照1g/5ml的料液比，加入5倍量0.10mol/lph6.0的磷酸盐缓冲溶液，将其用食品料理机均质(8000转/min均质10分钟)；得试样；

(2)称取试样2g，精确至0.01g，置于具塞离心管内，精密加入预先零度低温保存的10ml乙腈，漩涡振荡(3000r/min)提取15min，加入5g氯化钠和8g无水硫酸钠，漩涡振荡2min，以5000r/min的速度离心5min，精密吸取上清液8ml全部转移至10ml聚丙烯离心管中，待净化；

(3)在步骤(2)所得的待净化样液中加入净化剂，该净化剂由1500mg无水硫酸钠，250mgc18-n以及350mgnh2-psa组成，旋涡振荡2min混匀，以5000r/min的速度离心5min；

(4)精密取上清液5ml于40℃下氮吹至净干，精密加入0.5ml混合溶液(含0.1％(v/v)甲酸水溶液：甲醇＝65:35)，用0.22um过滤头过滤，得上清液；该上清液是供超高效液相色谱-串联质谱仪进行定性定量分析；

所述混合溶液由甲酸水溶液：甲醇＝65:35的体积比组成，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1％；

2)、制备标准溶液

(1)用甲醇分别将8种抗抑郁类药物标准物质溶解，配置成浓度为1mg/ml的8种抗抑郁类药物标准储备溶液；

(2)精密吸取8种抗抑郁类药物混合标准储备溶液适量，配置成8种抗抑郁类药物的浓度均分别为100ug/l的混合标准使用溶液；

(3)分别取均质后检测结果为阴性的空白鲫鱼样品8份，每份取2g，分别加入适量的混合标准使用溶液，按照步骤1)的“制备待测样品溶液”制备基质标准溶液，使得最终8份样品溶液中8种抗抑郁类药物浓度分别浓度为0.2ug/l、0.5ug/l、1ug/l、2ug/l、5.0ug/l、10ug/l、20ug/l、50ug/l，作为标准系列工作溶液；

说明：检测结果为阴性，可采用《environmentaltoxicologyandchemistry》2005年第24卷中的《determinationofselectantidepressantsinfishfromaneffluent-dominatedstream》法进行检测，所得结果为八种抗抑郁药物均为未检出时，判定检测结果为阴性。

3)、将步骤2)所得的标准系列工作溶液分别进行以下操作：注入超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪，确定8种抗抑郁类药物的出峰位置及其定性定量离子对，以定量离子对丰度为纵坐标，以浓度为横坐标，制作标准曲线方程。上述纵坐标、横坐标的数据单位分别是％、ug/l。

具体如下：

a)色谱柱：waterscortecsc18，100mm×2.1mm，1.6um色谱柱或相当；

b)流速：0.5ml/min；

c)柱温：40℃；

d)进样体积：1ul；

e)流动相：a(0.1％甲酸水溶液)：b(甲醇)＝65:35；

f)离子源：电喷雾离子源(esi)，正离子模式；

g)监测模式：多反应监测模式(mrm)；进行分段扫描：0～1.6min，文拉法辛；1.6～2.3min，西酞普兰；2.3～3.4min，帕罗西汀；3.4～4.3min，阿米替林；4.3～5.1min，氟西汀和曲米帕明；5.1～5.9min，舍曲林；5.9～7.0min，氯丙咪嗪；

h)干燥气：温度：200℃；流速：14ml/min；

i)毛细管电压：3.5kv；

j)毛细管出口电压(fragmentor)：380v；

k)其他质谱分析参数详见表3。

表3、8种抗抑郁类药物质谱分析参数

注：*为定量离子对

本发明公开的超高效液相色谱-三重四级杆质谱法在浓度范围0.2-50ug/l时，8种抗抑郁类线药物性关系均较好，见表4。

表4、空白鲫鱼中添加8种抗抑郁类药物的线性关系、检测限和定量限

4)、取步骤1)所得的上清液按步骤3)方法测定上清液中各抗抑郁类药物、峰面积及其定量定性离子对，根据各出峰时间以及定性定量离子对丰度比进行定性分析，

按照步骤3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中各抗抑郁类药物残留的含量。结果按下式进行计算：

式中：

x——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(ug/kg)；

c——从标准曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

m——样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。

5)、定性分析

对应步骤4)，每一成分都有2个检测通道，每一通道对应一个监测离子对。样品检测时，若某一成分对应的多个通道中均出现与对照品(基质标准溶液)保留时间一致的谱峰，并且这几个子离子的相对丰度与对照品一致，则可判定样品中检出该成分。各成分的丰度数据均符合欧盟2002/657/ec法规关于定性判断时相对离子丰度得允许偏差范围，可判断这些子离子的相对丰度一致。按上述法规的分值法(质谱分析方法鉴定点数)计算，上述定性过程如果大于3分的要求(如达到4分)，说明该样品中含有该种抗抑郁类药物残留。

6)、定量分析

对应步骤4)，本方法采用外标法定量，根据样品溶液中被测物质含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，对标准工作溶液与样液相同体积参插进样测定，标准工作溶液和待测样品溶液中8种抗抑郁类药物的响应值均应在线性范围内。

注1：如果样液的检测响应值超出线性范围，可对标准系列工作液进行适当调整。

注2：在上述色谱和质谱条件下，8种抗抑郁类药物的总离子流图和定性定量离子图参见图1。

7)、检测低限

以3倍信噪比(s/n＝3)确定最低检出浓度(lod)，以10倍信噪比(s/n＝10)确定最低定量浓度(loq)，本方法对适用于水产品中8种抗抑郁类药物的分散固相萃取净化-超高效液相色谱-串联质谱检测法的检测低限见表4。

实验1、样品添加回收率实验及精密度实验

分别在空白鲫鱼试样中加入8种抗抑郁类药物的标准混合溶液，添加浓度分别为0.2ug/kg，2ug/kg，10ug/kg，每个浓度设置6个重复，按上述前处理和分析方法，测定8种抗抑郁类药物在水产品中的添加回收率(线性方程同表4)，见表5。

表5、试样中添加不同浓度的抗忧郁类药物回收率及相对标准偏差(n＝6)

实验2、实际样品检测

将实验室随机抽取的15批次水产品，其中样品1～5号为鲫鱼，6～10号为黑鱼，11～15号为鲤鱼，还设置了样品16(已确认为空白的2g鲫鱼中添加了0.02ml的混合标准储备溶液)。

按上述操作步骤，进行提取、衍生、净化，每个样品平行2次，同时用空白的鲫鱼作相应的基质标准曲线，用液质联用仪进行测定，得到的样品测定结果见表6。

表6、实际样品测定结果(ug/kg)

nd：表示未检出。

根据表6我们得知：样品7中检出西酞普兰，样品11中检出舍曲林，其他样品(除样品16外)均为检出8种抗抑郁类药物残留。

验证实验1、将实验2所述的16个水产品按照bwbrooks等于2005年发表在《environmentaltoxicology&chemistry》24期第2卷的文献《determinationofselectantidepressantsinfishfromaneffluent-dominatedstream》进行检测，所得结果为：上述16批次样品均未检出含有8种抗抑郁类药物残留。

对比例1、将实施例1步骤1)(2)中的“精密加入预先零度低温保存的10ml乙腈”改成“精密加入10ml乙腈”；其余等同于实施例1。将实验2中的“样品16(已确认为空白的2g鲫鱼中添加了0.02ml的混合标准储备溶液)”按此方法进行检测，所得结果为：八种抗抑郁药物的回收率均低于50％，检测限均为0.2ug/kg，灵敏度和准确度明显降低。

对比例2、将实施例1步骤1)(3)中的“在步骤(2)所得的待净化样液中加入净化剂，该净化剂由1500mg无水硫酸钠，250mgc18-n以及350mgnh2-psa组成，旋涡2min混匀”改成“采用通过固相萃取柱来对样品进行净化，具体为：分别采用hlb、mcx、max三种固相萃取小柱进行样品的净化，取2ml的乙腈提取液，加入20ml水混匀，分别通过预先活化好的三种固相萃取小柱，2ml乙腈进行洗脱，40℃下氮吹至净干，精密加入0.5ml混合溶液(含0.1％(v/v)甲酸水溶液：甲醇＝65:35)，用0.22um过滤头过滤，得上清液”；其余等同于实施例1。将实验2中的“样品16”按此方法进行检测，所得结果为：均未检出。

对比例3、将实施例1步骤2)(3)改成“分别加混合标准储备溶液用甲醇(或者其他合适有机溶剂)配制成浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ug/l的混合标准工作溶液”；其余等同于实施例1。将实验2中的“样品16”按此方法进行检测，所得结果为：八种抗抑郁药物的回收率均低于30％，灵敏度和准确度明显降低。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显示，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所以变形，均应认为是本发明的保护范围。