多糖多酚植物组织双向电泳及高通量质谱分析的蛋白提取方法与流程

本发明涉及蛋白的提取方法，具体涉及一种多糖多酚植物组织双向电泳及高通量质谱分析的蛋白提取方法。

背景技术：

目前，蛋白组学研究已经发展成为研究植物基因功能的重要技术手段，可用来检测基因翻译后调控及表达情况，是一种比较新颖且有效的研究植物的方法。目前关于蛋白组学的研究技术有很多，如双向电泳，有标记及无标记的高通量质谱分析等都广泛的被用来研究某种特定生理生境下的全蛋白表达水平，差异及互作分析。

棉花是一种重要的经济作物，并且广泛用于生产纺织纤维和棉籽油。棉花叶片的蛋白组学研究能使我们对棉花叶片的光合效率，抵御病虫害及各种胁迫的分子机制有更深入的理解，从而进一步挖掘潜在关联基因，为棉花生长及纤维产量，品质的提高提供一定理论依据。

由于各种植物或组织无法提取固定得率的蛋白质，因为这些组织细胞中含有特定的物质能够降低所提取蛋白的质量及产率，因此在蛋白提取过程中需要针对特定的材料采取特定的提取处理方法。由于棉花叶片材料的特殊性，其含有多糖及多酚等多种干扰叶片蛋白提取的物质，多糖类物质可溶于水，从而导致蛋白质样品溶液粘稠并影响蛋白质的溶解，进而影响了蛋白质样品的上样量和电泳的质量。传统方法主要采用酚法进行了植物叶片蛋白质提取，利用多糖类物质不溶于酚相这一特征，可使用饱和酚萃取蛋白，从而除去样品中的多糖类及其他不溶于酚的物质，但酚法无法有效去除多酚类和盐类物质。因此，酚法提取得到的棉花叶片蛋白质质量不佳，无法用于下一步蛋白质组学分离，进而无法进行蛋白质组学分析，所以在棉花叶片的蛋白组学研究中的叶片蛋白提取方面仍面临有挑战。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种针对棉花叶片、同时适用于基于双向电泳及高通量质谱分析两种蛋白组学分析手段的多糖多酚植物组织双向电泳及高通量质谱分析的蛋白提取方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种多糖多酚植物组织双向电泳及高通量质谱分析的蛋白提取方法，包括以下步骤：

s1取1.0克棉花叶片加入聚乙烯吡咯烷酮粉末于液氮中研磨成粉末，其中聚乙烯吡咯烷酮粉末的含量为聚乙烯吡咯烷酮粉末和棉花叶片总质量的7％；用液氮研磨棉花叶片，可以研磨得更细，更充分，而且液氮低温使得细胞内的酶钝化，能够更好的保持蛋白质的完整性，为后续的组学分析做准备。

s2将步骤s1所得的粉末溶于冰水溶液混匀，置于－20℃下，沉淀12小时。利用冰水溶液对棉花叶片细胞进行有效破碎，得到蛋白质、糖类、脂类、细胞器、色素和甾醇等，蛋白质主要集中在沉淀层，而多数的糖类、脂类、色素、甾醇等物质都溶解于冰水溶液，也就是溶于上层清液，可将沉淀与上层清液分离。

s3取出步骤s2所得的沉淀，进行涡旋搅拌处理，并对沉淀进行离心处理；

s4用预冷的洗涤剂洗涤步骤s3离心处理后的沉淀若干次，每次洗完后，对沉淀进行离心处理，撇除上层清液，将沉淀于室温下风干；

s5在步骤s4风干后的沉淀中加入裂解缓冲液溶液至沉淀完全溶解，将溶解后的沉淀转移到新的离心管中；

s6在步骤s5盛有溶液的离心管中加入bpp提取缓冲液，室温涡旋搅拌后，再进行离心处理；

s7将在步骤s6盛有混合液的离心管中加入tris－饱和苯酚和浓度为0.1％蛋白酶抑制剂，室温涡旋搅拌后，再进行离心处理，取出上层清液备用；市售酚中含有醌等氧化物，而tris的主要作用是防治止酚类氧化，若酚类氧化，则会形成醌(两个苯环)，醌含有强自由基，会破坏核酸结构。同时，由于ph值大于7，在碱性环境中dna处于水相，rna处于有机相，从而使dna和rna分离。

s8在步骤s7离心所得的上层清液中加入bpp提取缓冲液，室温涡旋搅拌后，进行离心处理，再取上层清液，再在上层清液中加入过饱和甲硫酸铵，置于－20℃的温度下，直至有蛋白沉淀析出；

s9对步骤s8所得的上层清液和蛋白沉淀进行离心处理，取出沉淀并将沉淀悬浮于提前预冷的洗涤剂中洗涤若干次，每次洗涤后再进行离心处理，分离上层清液和沉淀，取出沉淀备用；

s10将步骤s9洗涤过的沉淀室温风干后，加入裂解缓冲液溶液至沉淀完全溶解，并将溶液储存于－80℃备用。

进一步，所述s2步骤中，冰水溶液为含有氯乙酸和2－巯基乙醇的丙酮溶液，其中氯乙酸溶液的含量为氯乙酸和2－巯基乙醇的丙酮溶液总质量的10％，2－巯基乙醇溶液的含量为氯乙酸和2－巯基乙醇的丙酮溶液总质量的0.07％。丙酮可以促进蛋白质沉淀，而2－巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。

更进一步，所述步骤s3、s6、s7和s8中，对离心管中溶液进行室温涡旋搅拌10分钟。

进一步，所述步骤s3、s4、s5、s6、s8和s9中，在温度为4℃和以20000rcf转速的条件下对沉淀离心15分钟以上。20000rcf高速转速的离心可以使得蛋白质和脂类物质进行有效分离。

再进一步，所述s5和s10步骤中，裂解缓冲液溶液为含有9mol/l尿素、chaps溶液、13mmol/ldtt和ipg缓冲液的混合液，其中chaps溶液的含量为裂解缓冲液溶液总质量的2％，ipg缓冲液的含量为裂解缓冲溶液总质量的1％。尿素可以降低蛋白质的活度系数促进其溶解，尿素添加不易过多，否则会使蛋白质变性。蛋白质溶解于裂解缓冲液溶液，进一步与不溶性杂质分离，提纯效果更好。

进一步，所述步骤s6中，离心管中bpp提取缓冲液的加入量为步骤s5离心管中溶液总体积的3倍。

更进一步，所述步骤s7中，tris－饱和苯酚的加入量为步骤s6离心管中溶液总体积的2倍，在温度为4℃和相对离心力为8000rcf的条件下，离心15分钟。

再进一步，所述步骤s8中，bpp提取缓冲液的加入量为与步骤s7离心所得的上层清液总体积相等，过饱和甲硫酸铵的加入量为步骤s7离心所得的上层清液和步骤s8中加入的bpp提取缓冲液总体积的5倍。

进一步，所述s8步骤中，将所得溶液置于－20℃的温度下6小时以上。

更进一步，所述步骤s4和s9中，预冷的洗涤剂的温度为－20℃。

特别地，步骤s4使用的洗涤剂通常为丙酮，步骤s9使用的洗涤剂通常为丙酮和甲醇。

本发明的有益技术效果为：解决传统酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚及多糖类等多种干扰叶片蛋白提取的物质的问题，实现了棉花叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于高通量质谱分析和双向电泳分析。

附图说明

图1为传统tca/丙酮提取法提取的棉花叶片总蛋白质双向电泳图谱；

图2为传统bpp提取法提取的棉花叶片总蛋白质双向电泳图谱；

图3为本发明提取的棉花叶片总蛋白质双向电泳图谱；

图4为传统tca/丙酮提取法提取的棉花叶片总蛋白质的高效液相色谱图；

图5为传统bpp提取法提取的棉花叶片总蛋白质的高效液体色谱图；

图6为本发明提取的棉花叶片总蛋白质的高效液体色谱图；

图7为传统tca/丙酮提取法提取的棉花叶片总蛋白质的质谱分析图；

图8为传统bpp提取法提取的棉花叶片总蛋白质的质谱分析图；

图9为本发明提取的棉花叶片总蛋白质的质谱分析图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

一种多糖多酚植物组织双向电泳及高通量质谱分析的蛋白提取方法，包括以下步骤：

s1取1.0克棉花叶片加入质量比为聚乙烯吡咯烷酮粉末于液氮中研磨成粉末，其中聚乙烯吡咯烷酮粉末的含量为聚乙烯吡咯烷酮粉末和棉花叶片总质量的7％；

s2将步骤s1所得的粉末溶于5ml冰水溶液混匀，置于－20℃下，沉淀12小时。利用冰水溶液对棉花叶片细胞进行有效破碎，得到蛋白质、糖类、脂类、细胞器、色素和甾醇等，蛋白质主要集中在沉淀层，而多数的糖类、脂类、色素、甾醇等物质都溶解于冰水溶液，也就是溶于上层清液，可将沉淀与上层清液分离。

s3取出步骤s2所得的沉淀，进行5－10分钟涡旋搅拌处理，并在4℃和以20000rcf转速的条件下对沉淀离心15分钟；而13000rpm高速转速的离心可以使得蛋白质和脂类物质进行有效分离，

s4用10ml预冷的－20℃丙酮洗涤步骤s3离心处理后的沉淀两次，每次洗完后，在4℃和以2000rcf转速的条件下，对沉淀离心15分钟，撇除上层清液，将沉淀于室温下风干；

s5在步骤s4风干后的沉淀中加入裂解缓冲液溶液至沉淀完全溶解，将溶解后的沉淀转移到新的离心管中；

s6在步骤s5盛有溶液的离心管中加入bpp提取缓冲液，bpp提取缓冲液的加入量为步骤s5离心管中溶液总体积的3倍，室温涡旋搅拌10分钟后，充分搅拌溶液，使溶液均匀混合，在温度为4℃和20000rcf转速的条件下，离心15分钟；

s7将在步骤s6盛有混合液的离心管中加入tris－饱和苯酚和浓度为0.1％蛋白酶抑制剂，其中，tris－饱和苯酚的加入量为步骤s6离心管中溶液总体积的2倍，在室温涡旋搅拌10分钟后，再在温度为4℃和相对离心力为8000rcf的条件下，离心15分钟，取出上层清液备用；

s8在步骤s7离心所得的上层清液中加入bpp提取缓冲液，室温涡旋搅拌10分钟后，在温度为4℃和20000rcf转速的条件下，离心15分钟，再取上层清液，再在上层清液中加入过饱和甲硫酸铵，置于－20℃的温度下，直至有蛋白沉淀析出，其中，bpp提取缓冲液的加入量为与步骤s7离心所得的上层清液总体积相等，过饱和甲硫酸铵的加入量为步骤s7离心所得的上层清液和步骤s8中加入的bpp提取缓冲液总体积的5倍；

s9对步骤s8所得的上层清液和蛋白沉淀在温度为4℃和20000rcf转速的条件下，离心15分钟，取出沉淀并将沉淀悬浮于提前预冷的－20℃丙酮和甲醇中洗涤各两次，每次洗涤后再在温度为4℃和20000rcf转速的条件下，离心15分钟，分离上层清液和沉淀，取出沉淀备用；

s10将步骤s9洗涤过的沉淀室温风干后，加入裂解缓冲液溶液至沉淀完全溶解，并将溶液储存于－80℃备用。

进一步，所述s2步骤中，冰水溶液为含有氯乙酸和2－巯基乙醇的丙酮溶液，其中氯乙酸溶液的含量为氯乙酸和2－巯基乙醇的丙酮溶液总质量的10％，2－巯基乙醇溶液的含量为氯乙酸和2－巯基乙醇的丙酮溶液总质量的0.07％。丙酮可以促进蛋白质沉淀，而2－巯基乙醇的加入既可以保护巯基不被氧化，进而维护蛋白天然构象，又可以保持多步处理时，样品蛋白质不会降解。

更进一步，所述s5和s10步骤中，裂解缓冲液溶液为含有9mol/l尿素、chaps溶液、13mmol/ldtt和ipg缓冲液的混合液，其中chaps溶液的含量为裂解缓冲液溶液总质量的2％，ipg缓冲液的含量为裂解缓冲溶液总质量的1％。尿素可以降低蛋白质的活度系数促进其溶解，尿素添加不易过多，否则会使蛋白质变性。蛋白质溶解于裂解缓冲液溶液，进一步与不溶性杂质分离，提纯效果更好。

进一步，所述s8步骤中，将所得溶液置于－20℃的温度下6小时以上。

为说明本发明的效果，将传统tca/丙酮提取法提取的棉花叶片总蛋白质双向电泳图谱图1、传统bpp提取法提取的棉花叶片总蛋白质双向电泳图谱图2与本发明提取的棉花叶片总蛋白质双向电泳图谱图3进行对比，结果表明：本发明提取蛋白适用于双向电泳分析：传统bpp提取法所提取的蛋白在双向电泳结果中有明显的条带拖尾现象。对双向电泳图上的胶点分析显示：传统bpp提取法所鉴定到的蛋白点的数目(445)要明显低于传统tca/丙酮提取法(981)及本发明(905)。故传统bpp提取法不适用于双向电泳分析，传统tca/丙酮提取法及本发明提取法适用于双向电泳分析。

将传统tca/丙酮提取法提取的棉花叶片总蛋白质的高效液相色谱图图4、传统bpp提取法提取的棉花叶片总蛋白质的高效液体色谱图图5与本发明提取的棉花叶片总蛋白质的高效液体色谱图图6进行对比，结果表明：传统tca/丙酮提取法提取的蛋白在酶解后经高效液相色谱分级的整个过程中在214nm下的吸收峰都很低，表明传统tca/丙酮提取法提取的蛋白杂质含量较高，酶解后蛋白含量很低，并不适用于棉花叶片的高通量蛋白组学研究。而传统bpp提取法及本发明提取法所提取的蛋白在整个分级过程中峰值普遍比传统tca/丙酮提取法高，表明这两种方法提取的蛋白纯度较高，能够避免杂质干扰，更适用于棉花叶片的高通量蛋白组学研究。

将传统tca/丙酮提取法提取的棉花叶片总蛋白质的质谱分析图图7、传统bpp提取法提取的棉花叶片总蛋白质的质谱分析图图8与本发明提取的棉花叶片总蛋白质的质谱分析图图9进行对比，结果表明：传统tca/丙酮提取法的质谱总离子信号强度要明显的低于传统bpp提取法及本发明提取法的离子信号强度。说明传统tca/丙酮提取法提取的蛋白在质谱上机的高通量蛋白组学分析中信号强度低，蛋白含量少，而传统bpp提取法和本发明提取法的离子信号强度较tca/丙酮提取法要高很多，所以传统bpp提取法及本发明提取法提取出的蛋白要更适合于质谱上机的高通量蛋白组学研究。

本发明的有益技术效果为：解决传统酚提取法提取植物叶片蛋白质产生时无法有效去除多酚及多糖类等多种干扰叶片蛋白提取的物质的问题，实现了棉花叶片总蛋白质的高效提取，获得蛋白质纯度高，可应用于高通量质谱分析和双向电泳分析。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。