气相色谱、质谱联用技术检测线虫中脂肪酸含量的方法与流程

本发明属于分析化学技术领域，特别涉及一种气相色谱、质谱联用技术检测线虫中脂肪酸含量的方法。

背景技术：

线虫其生命周期相对其他实验动物而言非常短暂便于周期性观察；培养条件非常简单，适于实验室培养；体型小，繁殖量大，保证实验样本的需求；而且它是一种有复杂调控的多细胞真核生物，意味它可能与高等动物有相似的细胞分子结构以及控制通路。因为它这些独特的生物学特性，被广泛应用于生命医学学科研究，是一种优秀的模式生物。

线虫体内的多不饱和脂肪酸合成通路结合了植物和动物的过程，与高等动物相比，具有完整的从头合成多不饱和脂肪酸的能力，适合开展游离脂肪酸相关的各类代谢组学研究。通过研究这些物质在线虫体内的作用机理进一步寻找在高等动物上的机制，为以后的深入研究提供准确的实验数据和理论依据。

深入开展游离脂肪酸相关的各类代谢组学研究，需要高效的、稳定的、能同时检测多种脂肪酸的分析测定方法。最常用的分析游离脂肪酸的方法有高效液相色谱、近红外以及气相色谱火焰离子化检测器等分析方法。然而，高效液相色谱方法检测游离脂肪酸，利用柱前衍生耗时长，近红外透射光谱技术分析的测定中相关系数都低于80％，结果相对较差，气相色谱火焰离子化检测器检测游离脂肪酸的响应时间长，灵敏度较低。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种气相色谱、质谱联用技术检测线虫中脂肪酸含量的方法，以解决现有检测分析测定方法耗时长、结果相对较差、响应时间长和灵敏度较低的问题，快速分析线虫中的脂肪酸组成及含量。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种气相色谱、质谱联用技术检测线虫中脂肪酸含量的方法，该方法包括以下步骤：

(1)配制标准品，用气相色谱、质谱联用方法进行检测，得各脂肪酸的保留时间和gc-ms图谱，并与质谱数据库进行对比，得到不同保留时间对应的脂肪酸组分；

(2)配制标准混合液，用内标法，建立气相色谱、质谱联用定性定量方法,所述定性定量方法是将目标化合物的质谱在质谱库中检索并对比，同时在相同的gc-ms条件下，待测物中目标脂肪酸与分析标准样品得到的保留时间和质谱对比定性，相似度≥95％时确认为该种化合物，定量方法为内标法；

(3)预处理线虫样品，获得分析试样；

(4)采用步骤(2)建立气相色谱、质谱联用定性定量方法对待测分析试样进行分析检测，得分析试样各脂肪酸的保留时间和gc-ms图谱；

(5)计算确定线虫样品中各脂肪酸的含量，所述线虫样品中各脂肪酸的含量按下式计算：

mi:样品中脂肪酸甲酯的含量；as：脂肪酸甲酯标样中内标物的峰面积；ai：样品中脂肪酸甲酯的峰面积；asi：样品中内标物的峰面积；ar：脂肪酸甲酯标样中脂肪酸甲酯的峰面积；mr：脂肪酸甲酯标样中脂肪酸甲酯含量。

在本发明的一种实现方式中，步骤(1)中所述标准品为棕榈酸甲酯16:0，棕榈油酸甲酯16:1，十八硬酸甲酯18:0，油酸甲酯18:1n9，亚麻油酸甲酯18:2n6，α-亚麻酸甲酯18:3n3，十八碳四烯酸甲酯18:4n3，花生四烯酸甲酯20:4n6，类花生酸甲酯20:5n3。

在本发明的一种实现方式中，所述内标法选用的内标物为十五碳烷酸甲酯c15:0。

在本发明的一种实现方式中，步骤(2)中所述标准混合液配制：

分别取步骤(1)中脂肪酸甲酯标准品，用正己烷配制成9种100μg/ml的标准储备液，将所述9种标准储备液用所述正己烷配制成10μg/ml的9种脂肪酸甲酯标准混合液，并用正己烷逐级稀释，得到质量浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20μg/ml的所述9种标准混合溶液，其中每个浓度梯度的所述9种标准混合溶液中均含1μg/ml的所述内标标准品c15:0。

在本发明的一种实现方式中，步骤(3)中所述线虫样品预处理：

将成年线虫清洗干净获得线虫样品，向所述线虫样品中添加所述内标液充分混匀，再加入h2so4/meoh溶液使其发生甲酯化反应，待反应结束萃取得到所述分析试样。

在本发明的一种实现方式中，所述获得线虫样品的方法为取成年线虫于1.5ml离心管中，以3500r/min转速离心2min去除上清培养基，加1mlpbs清洗，重复三次。

在本发明的一种实现方式中，所述h2so4/meoh溶液浓度为1～10％，h2so4/meoh溶液体积为750μl。

在本发明的一种实现方式中，所述甲酯化水浴温度55℃～85℃，所述甲酯化时间1～3h。

在本发明的一种实现方式中，步骤(1)所述的气相色谱、质谱联用方法中气相条件：色谱柱选用强极性的db-wax(30m，内径0.25mm，涂层厚0.25μm)；色谱柱起始温度50℃，保持1min；再以20℃/min的速率升温到180℃，保持5min；最后以8℃/min的速率升温到230℃，保持15min；载气为高纯氦气，0.5～1.5ml/min恒流流速，采用分流进样，分流比20:1～50:1；进样量1μl，进样口温度为200～250℃。

在本发明的一种实现方式中，步骤(1)所述的气相色谱、质谱联用方法中质谱条件为：ei电子轰击离子源，电子能量70ev；离子源温度：200～250℃；接口温度：200～250℃，溶剂延迟3.5min，采用选择离子扫描方式。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：

在本发明实施例提供的一种气相色谱、质谱联用技术检测线虫中脂肪酸含量的方法中，在预处理过程中用试剂将线虫里的游离脂肪酸预处理化，用内标法，建立气相色谱、质谱联用定性定量方法，采用气相色谱、质谱联用定性定量方法对对照标准品与待测线虫分析试样进行分析检测，计算确定线虫样品中各脂肪酸的含量，主要的9种从15碳到20碳脂肪酸都能得到较好的分离，在25min内就能取得满意的结果。该检测方法具有耗时短、污染小、检测限低、灵敏度高的优点，适用于快速分析线虫中的脂肪酸组成及含量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的gc-ms检测的总离子流图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

检测仪器：色谱系统：trace1300系列模块化气相色谱仪(美国thermofisher)；质谱系统：isq^tmlt单四极杆gc-ms系统(美国thermofisher)

仪器检测条件：

色谱条件

色谱柱：db-wax(30m×0.25mm×0.25μm，美国agilent)；

载气：高纯氦气，1.0ml/min，恒流流速；

进样方式：分流进样，分流比50:1；进样量1μl；

进样口温度：220℃；

程序升温：起始温度50℃，保持1min；再以20℃/min的速率升温到180℃，保持5min；最后以8℃/min的速率升温到230℃，保持15min。

质谱条件

电离方式：电子轰击离子源(ei)，电子能量70ev；

离子源温度：230℃；

传输线接口温度：230℃；

扫描模式：选择离子扫描；

溶剂延迟：3.5min。

本发明实施例提供了一种气相色谱、质谱联用技术检测线虫中脂肪酸含量的方法中，具体步骤包括：

(1)分别取脂肪酸甲酯标准品：棕榈酸甲酯(16:0)，棕榈油酸甲酯(16:1)，十八硬酸甲酯(18:0)，油酸甲酯(18:1n9)，亚麻油酸甲酯(18:2n6)，α-亚麻酸甲酯(18:3n3)，十八碳四烯酸甲酯(18:4n3)，花生四烯酸甲酯(20:4n6)，类花生酸甲酯(20:5n3)(纯度均≥98.5％)，用正己烷配制成9种100μg/ml的标准储备液，放置在-20℃冰箱中保存。

(2)以十五碳烷酸甲酯c15:0作为内标法选用的内标准品，取内标标准品十五碳烷酸甲酯c15:0，以正己烷为溶剂溶解稀释得100μg/ml的内标溶液。将9种标准储备液用正己烷配制成10μg/ml的9种脂肪酸甲酯标准混合液，并用正己烷逐级稀释，得到质量浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20μg/ml的9种标准混合溶液，其中每个浓度梯度的9种标准混合溶液中均含1μg/ml的内标标准品c15:0。

(3)取线虫于1.5ml离心管中，3500r/min离心2min去除上清培养基，加1mlpbs清洗，重复三次，以保证大肠杆菌被清洗干净。

取清洗干净的线虫样品于4ml玻璃管中，添加1μg内标液(10μg/mlc15:0脂肪酸甲脂)充分混匀。再加750μl5％h2so4/meoh溶液，涡旋混匀后置于80℃水浴2h，使其发生酯化反应，反应期间每隔30min取出振摇一次。待酯化反应完全并冷却至室温后，加入500μl0.9％的nacl溶液，涡旋混匀。

在以上溶液中加入300μl正己烷进行萃取，振荡混匀2min，静置后，3000r/min离心10min取上清液，重复提取3次，将三次提取的上清液合并置于1.5ml离心管中，以12000r/min离心10min，取上清，用正己烷定容至1ml，获得分析试样，放置-20℃冷冻保存，待gc-ms检测。

(4)将脂肪酸甲酯标准品注入气相色谱、质谱联用仪进行测定，扫描获得总离子流图。

将质量浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20μg/ml的9种标准混合溶液注入气相色谱、质谱联用仪进行测定，扫描得标准混合溶液的gc-ms图，参照标准混合溶液的gc-ms图，获得标准曲线，建立gc-ms定性定量方法。

(5)根据gc-ms检测的脂肪酸甲酯总离子流图，获得各脂肪酸的保留时间和gc-ms图谱，并与质谱数据库进行对比，得到不同保留时间对应的脂肪酸组分，相似度≥95％时确认为该种化合物。色谱图的保留时间和积分面积由工作站自动完成，利用nist谱库定性色谱峰。各脂肪酸组分的相对含量通过面积归一化法得到，绝对含量由对应的峰面积和内标物峰面积的比值乘以内标物的浓度得到。表1为10种脂肪酸甲酯的gc-ms参数，参见表1，本检测样中可辨认的脂肪酸甲酯的峰为10个。

表110种脂肪酸甲酯gc-ms参数

(6)分别对各脂肪酸的gc-ms图谱中的宽峰面积进行积分并加和，得到对应浓度的gc-ms信号响应值，用目标分析试样物浓度与内标物浓度的比值作为横坐标，用gc-ms信号响应值之比作为纵坐标，可得到各目标分析试样物的标准曲线。所有脂肪酸的定量内标、线性相关系数及仪器检出限见表2。其中信噪比(s/n)等于3的浓度定义为仪器检出限。从表2可知，脂肪酸仪器检出限在1.11～27.6ng/ml之间，定量限的范围为3.69～92.0ng/ml，线性相关系数均大于0.99，具有较好的线性关系，线性范围较宽(0.1～10μg/ml)，能够检测到较低浓度的目标化合物。

表29种脂肪酸甲酯的线性相关系数与检出限、定量限

(7)计算确定线虫样品中各脂肪酸的含量，线虫样品中各脂肪酸的含量按下式计算：

mi:样品中脂肪酸甲酯的含量，单位为mg/l；as：脂肪酸甲酯标样中内标物的峰面积；ai：样品中脂肪酸甲酯的峰面积；asi：样品中内标物的峰面积；ar：脂肪酸甲酯标样中脂肪酸甲酯的峰面积；mr：脂肪酸甲酯标样中脂肪酸甲酯含量，单位为mg/l。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。