基于蛋白结合诱导DNA双链变构的检测色氨酸的方法与流程

本发明涉及生物化学、分子生物学、氨基酸成分确认的检测方法，具体涉及一种基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测左旋色氨酸的方法。

背景技术：

左旋色氨酸（l-trp）是构成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是人体的8种必需氨基酸之一。作为重要的营养物质，许多的食物（原料、半成品、产品等）、饮料和调味品、饲料中都含有色氨酸。如何方便、快捷和准确的对色氨酸进行定量分析在食品和饲料等生物制品的检测中具有重要意义。

色氨酸在生物体内除了作为原料合成蛋白质外，其很多代谢产物具有重要的生物学功能及意义。人体内的色氨酸主要通过两种途径代谢：血清素途径和犬尿氨酸途径。在血清素代谢途径即5-羟色胺途径中，首先色氨酸羟化酶催化色氨酸生成5-羟色氨酸，然后在脱羧酶作用下5-羟色氨酸生成5-羟色胺。在犬尿氨酸途径中，吲哚胺2,3双加氧酶（ido）和色氨酸2,3双加氧酶（tdo）催化色氨酸生成n-甲酰犬尿氨酸。代谢过程中产生的5羟色胺是一种重要的神经递质，参与神经系统的众多生理功能的调节。犬尿喹啉酸是一种兴奋性氨基酸受体的拮抗剂。色氨酸代谢途径的异常可以引起体液中色氨酸浓度的变化。因此，对色氨酸浓度进行定量检测具有重要的生物学研究和健康检测价值。

目前，最常用的检测色氨酸的方法有hplc法、质谱法、层析法、紫外吸收法、荧光光谱法等。但是，这些检测分析方法均需要大型专业分析仪器设备，不仅需要专业人员来进行操作，而且对设备的使用和维护的要求也较高。目前，不依赖于大型仪器设备的可用于检测色氨酸的试剂盒常用的有elisa法，该方法利用色氨酸抗体与色氨酸的结合检测色氨酸，虽然降低了对大型专业仪器设备的要求，但是该检测方法需要包被、铺板、加样、加抗体、显色以及各步之间的多次洗涤操作，步骤繁琐，易于出现人为误差。此外，也有利用滚环扩增检测的方法，然而依赖酶促反应，影响因素复杂，而且不能进行“开启式”检测。因此，开发新的检测方法，实现简便、快捷、特异性高、性价比高的色氨酸一步检测技术具有重要的意义。

技术实现要素：

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提出一种基于蛋白结合诱导dna双链变构的全新的检测左旋色氨酸的方法，含有切刻位点的dna双链被茎环结构固定在弯折状态，通过色氨酸诱导的蛋白结合，将弯折dna双链变为直链，并打开茎环结构，通过该方法可以实现左旋色氨酸的简便、快捷、一步、可定量的检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白，通过识别并结合含有特异性识别序列和切刻位点的dna双链，使dna分子信标打开，发射荧光，荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。

所述的待检测的左旋色氨酸是制备的左旋色氨酸溶液，或是各种提取的含有左旋色氨酸的生物样本。

所述的色氨酸阻遏蛋白是细胞中调控色氨酸操纵子基因表达的阻遏蛋白trpr，左旋色氨酸特异性结合该蛋白能够提高该蛋白结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。

所述的dna双链，具有切刻位点，并能够形成分子信标，并含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列。

与现有技术相比，本发明采用蛋白结合诱导dna双链变构的全新的检测左旋色氨酸的方法具有下列优点。

1、操作简单、均相检测、一步检测。待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通过识别并结合含有特异性识别序列和切刻位点的dna双链，使dna分子信标打开，发射荧光，荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。检测方法可在30分钟之内完成，相对步骤多、耗时长的elisa技术具有明显操作优势。

2、不需专业的大型仪器设备。因此有利于开发不依赖hplc、质谱等大型仪器的快检试剂盒。

3、不依赖于酶促反应。与传统的生物检测方法不同，该技术采用全新原理，依赖于蛋白与dna双链的结合变构，而不需要酶及其参与的酶促反应，因此对于影响酶促反应的检测条件和复杂待检样品成分具有较强的适用性。

4、‘开启式’检测（turnondetection）：即待检分子存在时，出现信号或信号增强。通过与左旋色氨酸标准样品的荧光强度比较，即可测定出待测样品中的左旋色氨酸含量。

附图说明

图1是本发明的流程图。

图2是本发明检测色氨酸的原理示意图。图中，1、含有trpr识别序列以及荧光基团和淬灭基团的分子信标，2、含有trpr识别序列的互补链dna，3、阻遏蛋白，4、色氨酸。

图3是本发明定量测定不同浓度色氨酸的测定结果。（a）不同浓度色氨酸的荧光强度，（b）色氨酸浓度和荧光强度的线性关系。fluorescenceintensity(fi)：荧光强度，time：时间，l-trpconcentration(μm)：左旋色氨酸浓度（微摩尔每升）。

图4是本发明特异性检测色氨酸和其他19种氨基酸的测定结果。fluorescenceintensity(fi)：荧光强度；l-trp：左旋色氨酸；l-phe：左旋苯丙氨酸；l-tyr：左旋酪氨酸；l-ser：左旋丝氨酸；l-thr：左旋苏氨酸；l-met：左旋甲硫氨酸；l-cys：左旋半胱氨酸；l-gln：左旋谷氨酰胺；l-asn：左旋天冬酰胺；l-pro：左旋脯氨酸；gly：甘氨酸；l-ala：左旋丙氨酸；l-leu：左旋亮氨酸；l-ile：左旋异亮氨酸；l-val：左旋缬氨酸；l-glu：左旋谷氨酸；l-asp：左旋天冬氨酸；l-lys：左旋赖氨酸；l-arg：左旋精氨酸；l-his：左旋组氨酸。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明。

本发明基于蛋白结合诱导dna双链变构的检测左旋色氨酸的方法包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，增加色氨酸阻遏蛋白对其核酸识别序列的亲和力，结合在分子信标的dna双链上，使分子信标打开，并发射荧光。分子信标的荧光强度与左旋色氨酸的浓度成正比。该方法包括待检测的左旋色氨酸溶液、色氨酸阻遏蛋白、分子信标、dna互补链。其中，待检测的左旋色氨酸是配制的左旋色氨酸溶液，或是各种提取或制备的生物样本。色氨酸阻遏蛋白是细菌中调控色氨酸操纵子表达的阻遏蛋白trpr，该蛋白能够特异性地结合左旋色氨酸，并发生构象变化，提高了结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。dna双链，具有切刻位点，并能够形成分子信标，并含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列。

实施例1。

本发明利用分子信标荧光强度定量测定l-trp浓度（图3）。具体步骤如下。

（1）检测体系。

配制100μl的检测体系（10mmtrisph7.5、10mmmgcl2、1mmdtt、50mmnacl、50nm分子信标、50nm互补链和trpr2.5μm），分别加入不同量的l-trp，使其终浓度为0、1、2、4、6、8、10μm。上述所用试剂可通过正规生物技术和试剂公司常规订购，按试剂说明及实验室常规规范配制、储存和使用。

（2）荧光的检测与作图。

利用多功能酶标仪（microplatereader，infinitem200，tecan，usa）检测分子信标的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm，每分钟一测，检测30min。分子信标的荧光值对色氨酸浓度作图，使用线性回归，定量分析色氨酸浓度（图3）。

实施例2。

本发明特异性鉴别l-trp和其他19种氨基酸（图4）的具体步骤如下。

（1）检测体系。

配制100μl的检测体系（10mmtrisph7.5、10mmmgcl2、1mmdtt、50mmnacl、50nm分子信标和trpr2.5μm），分别加入一种氨基酸。氨基酸的终浓度分别是10μm色氨酸（l-trp）和1.0mm（其他氨基酸：gly、l-ala、l-ile、l-leu、l-met、l-val、l-arg、l-his、l-lys、l-asp、l-asn、l-glu、l-gln、l-ser、l-thr、l-phe、l-tyr、l-cys和l-pro）。上述所用试剂可通过正规生物技术和试剂公司常规订购，按试剂说明及实验室常规规范配制、储存和使用。

（2）荧光的检测与作图。

利用多功能酶标仪（microplatereader，infinitem200,tecan,usa）检测分子信标的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm，每分钟一测，检测30分。取分子信标的最大荧光值对不同氨基酸种类作图，比较不同氨基酸的荧光值，定性鉴别色氨酸（图4）。