一种定量检测碱性磷酸酶活性的方法与流程

本发明涉及一种定量检测碱性磷酸酶活性的方法，属于酶检测技术领域。

背景技术：

碱性磷酸酶(简称alp)广泛存在于哺乳动物体内，它具有催化磷酸酯水解的能力。此外，alp通常被用作临床诊断的重要生物标志物，因为其含量异常与许多疾病如骨病，糖尿病，前列腺癌和肝功能障碍密切相关。因此，开展高灵敏及高选择性的alp检测方法的研究具有重要意义。常用于alp检测的方法有荧光光谱法、比色法、电化学法及化学发光法等。其中，荧光光谱法因其具有灵敏度高、操作简单和响应快等优势，引起人们广泛关注。荧光光谱法检测alp大多基于有机荧光探针、半导体量子点、荧光共聚物和贵金属纳米簇等作为荧光探针。但是有机荧光探针水溶性较差，半导体量子点毒性较大，荧光共聚物制备步骤复杂且费时，贵金属纳米簇成本较高且稳定性差。因此，发展新型荧光探针用于alp检测具有重要的意义。

c-dots具有水溶性好、合成方法简单、成本低及稳定性好等优势，在alp荧光光谱检测表现出巨大的潜力。有研究利用c-dots-cu²⁺-ppi体系成功实现了alp的荧光光谱法检测；但所用的碳量子点的制备需要利用浓酸处理方法，较为危险。有研究发展了一种c-dots-mno2纳米片检测alp的方法。但该方法中所用的mno2纳米片制备方法较为复杂和费时，限制了它在实际检测中的应用。还有研究利用β-环糊精修饰的c-dots检测alp，c-dots的表面修饰方法较为复杂。因此，需要发展简单及环境友好的方法用于c-dots的制备，并将制备的c-dots无须额外修饰或利用其它材料直接用于alp的检测。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种定量检测碱性磷酸酶活性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种定量检测碱性磷酸酶活性的方法，其包括如下步骤：

制备碳量子点；

将二乙醇胺缓冲液、氯化镁溶液、抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、碳量子点和去离子水混匀，得到测试液；

将所述测试液均为若干份，除一份不加碱性磷酸酶作为对照样外，其余各份中分别加入不同已知浓度的碱性磷酸酶，混匀后，均在37℃下进行孵育；

孵育结束后，分别进行荧光光谱测试，得到碱性磷酸酶的活性和荧光强度关系式，如式i所示：

(f0-f)/f0＝0.004+0.070ci；

式中：c为碱性磷酸酶的活性，单位是muml^-1，f0为空白样的荧光强度值，f为测试样的荧光强度值，线性相关系数为0.994。

作为优选方案，所述碳量子点的制备方法为：

将3-氨基苯硼酸溶于超纯水中，加入氢氧化钠溶液，在180℃下进行水热反应后，得到碳量子点溶液。

作为优选方案，所述孵育时间为30～200min。

本发明的基本原理如图9所示：以3-氨基苯硼酸为原料，采用水热法制备了具有硼和氮双掺杂的c-dots。将制备的碳量子点作为荧光探针，2-aap作为alp酶底物。利用alp水解2-aap形成的aa与c-dots表面的硼酸基团作用，导致c-dots聚集引起其荧光淬灭。基于c-dots荧光强度随alp加入浓度的变化关系可实现alp的检测。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、采用碳量子点作为荧光探针，具有制备方法简单、成本低、绿色环保等优势；此外，该碳量子点无需复杂的修饰或使用浓酸处理。

2、alp检测方法较为简单，只需将c-dots，alp，2-aap，缓冲溶液混合孵育即可测定。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明中实施例1制备的碳量子点的低分辨率透射电镜照片；

图2为本发明中实施例1制备的碳量子点的高分辨率透射电镜照片；

图3为本发明中实施例1制备的碳量子点的粒径分布图；

图4为3-氨基苯硼酸和本发明中实施例1制备的碳量子点的红外光谱图；

图5本发明中实施例1制备的碳量子点的xps图谱；

图6本发明中实施例1制备的碳量子点的c1s谱图；

图7本发明中实施例1制备的碳量子点的n1s谱图；

图8本发明中实施例1制备的碳量子点的b1s谱图；

图9为本发明中利用碳量子点检测碱性磷酸酶的原理示意图；

图10为向本发明中实施例3制备的检测液中加入不同浓度的碱性磷酸酶后的荧光光谱；

图11为由本发明中实施例3得到的(f0-f)/f0与碱性磷酸酶的活性的关系曲线；

图12为由图8经过线性拟合得到的(f0-f)/f0与碱性磷酸酶的活性的关系图；

图13为本发明中实施例4得到选择性测试结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明中所涉及的缩写及术语解释：c-dots：碳量子点；alp：碱性磷酸酶；2-aap：抗坏血酸-2-磷酸三钠盐；aa：抗坏血酸；na3vo4：正钒酸钠；二乙醇胺：dea；ppi：焦磷酸根；abpa：3-氨基苯硼酸；bsa：牛血清蛋白；f0：alp加入前体系荧光强度；f：alp加入前体系荧光强度；xps：x射线光电子能谱。

实施例1

本实施例涉及一种碳量子点的制备方法，具体包括如下步骤：

0.1g3-氨基苯硼酸(abpa)溶于10ml超纯水中，在搅拌的情况下加入0.2mlnaoh(0.1m)。得到的均一溶液置于反应釜中，180℃反应4h，自然冷却至室温后，将所得到的溶液10000rpm离心10min，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得到碳量子点溶液，将其置于4℃冰箱中保存备用。

本实施例制备的碳量子点的形貌与结构表征：

分别利用高分辨率透射电镜和低分辨率透射电镜进行表征，结果如图1、2和3所示，碳量子点分散较为均一，粒径分布为1.3～4.0nm，平均粒径为2.4nm。采用傅里叶变换红外光谱及xps对c-dots组成进行了表征，结果如图4所示，其在3385cm^-1处出现了n-h的伸缩振动峰，1356cm^-1处有b-o的不对称伸缩振动峰，1167cm^-1处为b-o-h的弯曲振动峰，1108cm^-1为c-n伸缩振动峰，1030cm^-1为b-o-h的变形振动；如图5～8所示，从其xps全谱图中可看出，碳量子点包含c、n、b和o四种元素；其c1s分峰拟合，得到三个峰位于284.1ev，284.8ev，285.8ev分别对应c-b，c-c/c＝c和c-o/c-n；n1s分峰得到的三个峰位于399.4ev，400.1ev，401.5ev分别对应于吡啶氮、吡咯氮和石墨氮；b1s分峰拟合得到的两个峰位于191.4ev和192.7ev，分别对应b-c和b-o。上述结果表明，b和n成功掺杂于碳量子点，同时碳量子点具有硼酸基团。

实施例2

本实施例涉及一种碱性磷酸酶检测液的制备方法，具体包括如下步骤：

将380μldea缓冲溶液(1m，ph9.8)，10μl50mmmgcl2，100μl40mm2-aap，10μlc-dots和490μl超纯水依次加入到1.5ml离心管中，混合均匀后，得到碱性磷酸酶检测液，备用。

实施例3

本实施例涉及一种碱性磷酸酶的检测方法，具体包括如下步骤：

取17份实施例2制备的碱性磷酸酶检测液，各加入10μl不同浓度的碱性磷酸酶溶液，控制各碱性磷酸酶溶液的浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、30.0和50.0muml^-1，均混合均匀后，均在37℃下孵育2h后，进行荧光光谱检测，得到碱性磷酸酶活性和荧光强度的关系曲线，如图10和11所示，对图10进行线性拟合后，得到如图12所示的线性方程，函数关系式如式i所示：

(f0-f)/f0＝0.004+0.070ci；

式中：c为碱性磷酸酶的活性，单位是muml^-1，f0为空白样的荧光强度值，f为测试样的荧光强度值，线性相关系数为0.994。

实施例4

本实施例涉及一种利用实施例2制备的碱性磷酸酯检测液在检测碱性磷酸酶时的选择性测试，具体包括如下步骤：

将380μldea缓冲溶液(1m，ph9.8)，10μl50mmmgcl2，100μl40mm2-aap，10μl0.05mgml^-1干扰物质(牛血清蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰酶)，10μlc-dots和490μl超纯水依次加入到1.5ml离心管中，混合均匀后置于37℃水浴锅内孵育2小时后进行荧光光谱测试。

将370μldea缓冲溶液(1m，ph9.8)，10μl50mmmgcl2，100μl40mm2-aap，10μl0.05mgml^-1alp，10μl0.05mgml^-1干扰物质(牛血清蛋白、溶菌酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰酶)，10μlc-dots和490μl超纯水依次加入到1.5ml离心管中，混合均匀后置于37℃水浴锅内孵育2小时后进行荧光光谱测试。

检测结果如图13所示。其他酶或bsa单独加入到体系中不会引起荧光强度明显变化，只有alp单独或与这些酶、bsa同时加入时体系荧光强度明显降低，说明该方法的选择性较好。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。