一种汞离子的检测方法与流程

本发明涉及汞离子的检测领域，特别是将碎片dna形成dna酶的无酶放大技术和血红素-氧化石墨烯复合物催化显色反应联用的汞离子检测方法领域。

背景技术：

汞作为毒性最大的重金属之一，对环境安全和人类健康问题的不利影响，引起了公众的广泛关注。各种自然和人类活动普遍存在汞污染。饮用水中汞的最大污染物水平(mcl)由世界卫生组织(who)设定为30nm。现有技术将hg²⁺嵌入胸腺嘧啶-胸腺嘧啶(t-t)错配中形成了t-hg²⁺-t碱基对，建立了各种hg²⁺检测分析方法，包括比色法，荧光，表面增强拉曼散射和电化学检测方法。然而，检测限都大于30nm，检测灵敏度不高。为了提高灵敏度，无酶放大技术用于信号放大，如杂交链反应和核酸分子发夹催化装自组装。由于等温条件，成本低廉和无需酶参与等条件引起了很多关注。然而，大多数无酶放大技术需要设计复杂的辅助核酸分子发夹。

由于血红素在水溶液中的溶解度低和分子聚集度高，难以直接应用其作为催化剂。现有技术中通过血红素和go之间的π-π相互作用合成血红素-氧化石墨烯复合物。go用作血红素的载体，为血红素的提供导电性。因此，它显示出过氧化物酶活性，催化过氧化物酶底物的显色反应。但是，由于血红素-氧化石墨烯复合物在盐溶液中易聚集沉降，使得离心后的上清液催化效果并不明显。此外，血红素-氧化石墨烯复合物在氯化钠存在时显示出对单链或双链dna序列的不同的分散特性。因此被用于检测过氧化氢，葡萄糖，酶活性，双酚a和dna损伤。

尚无将碎片dna形成dna酶的无酶放大技术和血红素-氧化石墨烯复合物催化显色反应两种技术联用来检测汞离子的报道。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供一种将碎片dna形成dna酶的无酶放大技术和血红素-氧化石墨烯复合物催化显色反应联用的汞离子检测方法。上述“血红素-氧化石墨烯复合物”下文简称为h-gns。

本发明的检测原理为：在hg²⁺存在下，两个dna酶序列碎片可以通过t-hg²⁺-t相互作用在中间形成双链体部分，在两端变成两个完整的dna酶链。dna酶链与核酸分子发卡环部的底物链序列结合生成dna酶结构。dna酶可以循环剪切核酸分子发卡的环部，产生大量的dna片段。得到的dna片段可以通过吸附在h-gns表面上来防止h-gns在盐溶液中聚集。因此，离心后上清液中含有更多分散的h-gns，在显色反应后，上清液显示出深蓝色。然而，在没有hg²⁺的情况下，h-gns在没有dna片段保护的情况下发生聚集，离心后上清液中还有少量的h-gns，产生浅蓝色。核酸分子发卡的环状切割导致hg²⁺检测的显著信号放大。该方法提供了一种显色和无酶放大模式，可快速灵敏地检测hg²⁺，无需复杂的辅助发夹设计。

本发明包括如下步骤：

(1)h-gns的合成，采用现有技术合成h-gns；

(2)将核酸分子发卡序列5’-caccacaaattctctctraggacaaaaaaagtggtg-3’加热到90℃保持5分钟，然后冷却2小时至室温形成核酸分子发卡结构；

(3)dna酶的形成，在10mmtris-hcl(ph7.5)缓冲中将购得的50nm碎片dna酶序列1和碎片dna酶序列2与hg²⁺的待测液和200nm步骤(2)所得核酸分子发卡混合反应，形成dna酶结构，

上述碎片dna酶序列1为5’-ttttgtcagcgatccggaattgtggttggtgcggcacccatgtgagagaa-3’，

上述碎片dna酶序列2为5’-ttttgtcagcgatccggaactccttcctcttcggcacccatgtgagagaa-3’；

(4)核酸分子发卡环的剪切，核酸分子发卡环的剪切，将步骤(3)所得溶液和10mmmg²⁺溶液混合反应15分钟；

(5)h-gns催化剂的形成，用tris-hcl溶液稀释混合步骤(1)所得h-gns和步骤(4)，温育并加入适量nacl，离心取上清液，该上清液即h-gns催化剂；

(6)显色和测定，将步骤(5)所得h-gns催化剂用于催化含tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和h2o2的tris-hcl缓冲溶液的显色反应，测定其uv-vis吸收光谱，并用标准曲线法计算hg²⁺浓度。

优选的，步骤(1)具体为：具体为：将20ml含有10mg氧化石墨烯(以下简称go)的水超声处理1小时，然后，将20ml的0.5mgml^-1血红素溶液与上述go分散体混合并摇动几分钟，然后依次加入200μl氨水溶液和30μl水合肼，在60℃下搅拌3.5小时，离心30分钟，沉淀用超纯水冲洗数次。用超纯水稀释至0.3mgml^-1备用。

优选的，步骤(5)所用tris-hcl溶液ph值为7.5，步骤(6)所用tris-hcl溶液ph值为5。

优选的，步骤(6)测定的uv-vis吸收光谱是500至800nm范围内的。

本发明创造性地将碎片dna形成dna酶的无酶放大技术和h-gns催化显色反应联用来检测汞离子，其作为不可分割的整体，不但特异性识别汞离子和放大检测信号，更省去了复杂的辅助核酸分子发夹设计，解决了h-gns易聚集催化效果不佳的问题。

附图说明

图1为本发明检测过程示意图。

图2(a)go，血红素和h-gns的紫外-可见吸收光谱。图2(b)合成的h-gns的afm图像。图2(c)为go的afm图像。

图3为不同不同检测方法的吸光度对比。

具体实施例

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

提供一种碎片dna形成dna酶的无酶放大技术和h-gns催化显色反应联用的汞离子检测方法，检测示意图参见图1，其具体步骤为：

(1)h-gns的合成，将20ml含有10mggo的水超声处理1小时，然后，将20ml的0.5mgml^-1血红素溶液与上述go分散体混合并摇动几分钟，然后依次加入200μl氨水溶液和30μl水合肼，在60℃下搅拌3.5小时，离心30分钟，沉淀用超纯水冲洗数次。

合成的石墨烯复合物通过uv-vis吸收光谱表征。在230nm附近存在强吸收峰(图2a)，其对应于芳族c＝c的π-π*跃迁，以及290-300nm处的肩，其对应于n-π*跃迁。c＝o键。此外，血红素显示两个特征吸收，386nm处的b波段峰值和480-670nm附近的q波段峰值。合成的石墨烯复合物显示35nm的go峰红移至265nm，并且在418nm处的吸收峰对应于具有32nm红移的血红素的b吸收带。红移表示go和血红素之间的π-π相互作用。这些结果与先前的报道一致，即阳离子卟啉衍生物与化学转化的石墨烯的相互作用导致卟啉soret带的红移。

afm用于表征石墨烯复合物纳米片的表面(图2b)。h-gn的平均厚度约为1.2nm。与裸go相比，厚度增加约0.25nm(图2c)。这可能是由在go表面上吸收的0.2nm单层血红素引起的。紫外-可见光谱和afm表明血红素分子成功附着在go表面。

(2)将核酸分子发卡序列5’-caccacaaattctctctraggacaaaaaaagtggtg-3’加热到90℃保持5分钟，然后冷却2小时至室温形成核酸分子发卡结构；

(3)dna酶的形成，在10mmtris-hcl(ph7.5)缓冲中将购得的50nm碎片dna酶序列1和碎片dna酶序列2与hg2+的待测液和200nm步骤(2)所得核酸分子发卡混合反应，形成dna酶结构，

上述碎片dna酶序列1为5’-ttttgtcagcgatccggaattgtggttggtgcggcacccatgtgagagaa-3’，

上述碎片dna酶序列2为5’-ttttgtcagcgatccggaactccttcctcttcggcacccatgtgagagaa-3’；

(4)核酸分子发卡环的剪切，将步骤(3)所得溶液和200nm步骤(2)所得核酸分子发卡以及mg²⁺溶液混合反应15分钟；

(5)h-gns催化剂的形成，用tris-hcl溶液(ph7.5)稀释混合适量步骤(1)所得h-gns和40μl步骤(4)所得溶液，温育并加入适量nacl，离心取上清液，该上清液即h-gns催化剂；

(6)显色和测定，将30μl步骤(5)所得h-gns催化剂用于催化800μμtmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和10mmh2o2和760μltris-hcl溶液(ph5)的显色反应，使用分光光度计记录500至800nm的uv-vis吸收光谱，测定hg²⁺浓度定量。

实施例2

该方法用于检测中草药白术中的hg²⁺。简而言之，将1g白术粉碎并通过100目筛。将粉末在120℃下干燥10小时。然后，加入100mlhno3并加热。然后，逐滴加入h2o2直至溶液变为透明。用超纯水将溶液稀释至200ml，并用0.45微米过滤器过滤。在测试之前将溶液的ph调节至7.5作为待测液。其余检测过程同实施例1。结果显示，两个不同白术样品中hg²⁺的浓度分别为68.7μg·kg^-1和72.1μg·kg^-1。加标10和20μg·kg^-1后回收率为91％和97％。

对比例

为体现上述实施例的技术效果，特提供以下对比例：对比例1：舍去h-gns，其余测试过程和实施例1相同；对比例2：将h-gns用go替换，其余测试过程和实施例1相同；对比例3：和实施例1相同；对比例4：空白样品，即待测液中不含汞离子，其余测试过程和实施例1相同；对比例5：碎片dna酶序列与核酸分子发卡的摩尔比降至1：2，其余测试过程和实施例1相同；对比例6：剪切反应时间减少至5分钟，其余测试过程和实施例1相同。

结果显示在图3中，1号为对比例1的吸光度信号，由于不存在h-gn的情况下没有显色反应。2号为对比例2的吸光度信号，显示出与对比例1相似的吸光度，这意味着血红素对于显色反应是有显著影响的，在hg2+存在下，它可以诱导整个dna酶的形成和核酸分子发卡的催化剪切，产生大量的dna片段和显色反应为深蓝色，如对比例3，即实施例1的吸光度信号--3号所示。4号为对比例4的吸光度信号，即空白信号，没有hg2+不能诱导催化剪切反应，导致少量dna片段和显色反应为浅蓝色，表明本发明的方法对hg2+的识别是特异性的。5号为对比例5的吸光度信号，当碎片dna酶序列与核酸分子发卡的摩尔比降至1：2时；这意味着dna酶与核酸分子发卡的摩尔比为1：1，并且不能引发循环剪切放大反应。6号为对比例6的吸光度信号，由于剪切反应引起的少量dna片段，δ吸光度强度相对较低。当剪切反应时间减少至5分钟时，δ吸光度强度降低。这可归因于三分之一的孵育时间导致循环剪切放大反应未完成。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。