一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备方法与流程

本发明属于纳米复合材料与分子印迹聚合物的制备技术领域，具体涉及一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备方法，其制备的传感器可用于藻红蛋白的高灵敏度和高选择性检测。

背景技术：

当前，海洋表面大规模繁殖的红藻造成的赤潮现象越来越严重，其对人体健康和水生资源的危害引起了广泛的社会关注。藻红蛋白是海藻中重要的捕光色素蛋白之一，其与藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白构成了藻胆蛋白的荧光家族。这些蛋白质是有效能量传递链的一部分，它将光捕获的复合物激发能量引导至含有叶绿素的反应中心，光能传递效率可达到95％。藻红蛋白主要从红藻中分离和纯化获得，其具有强荧光，良好的光吸收特性，高量子产率，以及在可见光区域存在广泛的激发和发射等特性。藻红蛋白可广泛用于诊断和生物工程技术领域，如荧光免疫分析、双色或多色荧光分析、癌细胞表面抗原检测、流式细胞技术、抗体荧光标记、生物成像、食品、化妆品等领域。对藻红蛋白进行精确检测仍然是当前亟待解决的问题之一，开发一种简单高效的鉴定和检测藻红蛋白的方法具有重要的意义。

分子印迹技术可在特定模板分子的存在下，将其高灵敏和高选择性地捕获到聚合物分子空穴中。在制备过程中，通过洗脱去除模板分子引起特定位点保留在形成的聚合物网络中，且形状和大小与模板分子相匹配。分子印迹聚合物的特异性位点和模板分子之间存在匹配关系，可实现对模板分子的高选择性和特异性检测。作为一种特殊的受体形式，分子印迹聚合物具有制备简单、廉价、选择性好、物理强度高、热稳定性好等优点，已被广泛应用于化学/生物传感器、色谱分离、固相萃取、药物释放等诸多重要领域。

经文献检索发现：munier等从红色食用海藻中采用一步法纯化制得r-藻红蛋白(mathildemunier,michèlejustinedumay,pascaljaouen,fleurence.one-steppurificationofr-phycoerythrinfromtherededibleseaweedgrateloupiaturuturu.journalofchromatographyb,992(2015)23–29.)，其中r-藻红蛋白采用高效液相色谱法检测；gameiro等对藻红蛋白进行了荧光表征(carlagameiro,andreib.utkin,paulocartaxana.characterisationofestuarineintertidalmacroalgaebylaser-inducedfluorescence.estuarine,coastalandshelfscience167(2015)119–124)；吴继魁等报道了一种利用r-藻红蛋白荧光来检测dna杂交的方法(吴继魁,陆云飞,任宁娜,张俊玲.一种利用表面阳离子化的r-藻红蛋白检测dna杂交的方法.中国发明专利.公开号cn108037103a)；王华林等制备了一种藻红蛋白标记的聚苯乙烯微球用作荧光探针(王华林,张涛,张科登.一种藻红蛋白标记聚苯乙烯微球的荧光探针制备方法.中国发明专利.公开号cn108383936a)。

当前有关藻红蛋白的研究集中在提取、分离、纯化和用作荧光标记探针的研究，对藻红蛋白的分析检测局限于使用高效液相色谱仪和荧光光谱仪进行定量。传统的仪器分析技术普遍存在样品前处理繁琐，操作复杂，耗时费力，灵敏度低，选择性差等问题。在藻红蛋白的检测中，仅仅依赖单一信号输出，这种检测模式易受背景、试剂、系统和环境条件等因素的影响，导致测定结果波动。相比而言，采用双信号比值处理获得信号的强度比率，具备自校准功能，有效消除了自体和背景信号的干扰，提高了检测结果的准确性和可靠性。基于此，本发明报道了一种新颖的基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器。以fe3o4磁性纳米粒为中心，在其表面偶联蓝荧光发射的碳量子点(b-cds)，在fe3o4/b-cds表面生长负载了模板分子(藻红蛋白)的二氧化硅壳层，洗脱模板分子制得分子印迹聚合物sio2-mips，即制得fe3o4/b-cds/sio2-mips。该磁性分子印迹核/壳聚合物可用于高灵敏和高选择性比率荧光检测藻红蛋白。截止目前，尚未有采用基于fe3o4/b-cds/sio2-mips磁性分子印迹核/壳聚合物来构建比率荧光传感器，以及采用比率荧光方法来检测藻红蛋白的国内外文献和专利的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，设计一种方法简单、成本低廉、灵敏度高、选择性好的一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备方法。

为了实现上述目的，本发明涉及的一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备工艺包括以下步骤：

1.一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：

(1)氨基化蓝荧光发射b-cds的制备：取0.3ml乙二醚和25ml儿茶酚溶液超声混匀，转入50ml聚四氟乙烯内胆的高压反应釜中，在180℃下加热反应12h，将制得的深棕色混合液用20ml二次蒸馏水稀释，以12000rpm转速离心除去较大颗粒，收集上清液并采用0.4μm微滤膜过滤，滤液采用截留分子量1000da透析袋透析处理以清除未反应实验原料，将透析袋中溶液倒出，采用旋转蒸发除去90％的液体，再真空干燥得到b-cds，在4℃避光条件下储存，或分散在溶液中制备b-cds的分散液用于后续实验。

(2)羧基化fe3o4磁性纳米粒的制备：向250ml反应瓶中加入摩尔比为2:1的氯化铁和氯化亚铁配成100ml混合溶液，在n2保护下向反应瓶中加入质量浓度为25％的10ml氨水，快速搅拌反应，用hcl调节溶液ph至碱性，反应10min后加入10ml柠檬酸三钠溶液，将反应瓶放置于80℃的水浴锅中继续搅拌反应30min，产物经离心，洗涤和干燥处理得到fe3o4，在4℃避光条件下储存，或分散在溶液中制备fe3o4的分散液用于后续实验。

(3)磁性分子印迹核/壳聚合物的制备：取2mlb-cds水分散液加入到18ml含有0.8mlfe3o4的水分散液中，搅拌反应30min后，加入模板分子藻红蛋白和20μl3-氨基丙基三乙氧基硅烷，继续反应1h，再加入40μl氨水和40μl硅酸四乙酯，在避光处反应12h，将产物离心，用乙醇/乙腈(体积比为8:2)洗涤三次，除去模板分子，产物经离心，洗涤和干燥处理得到fe3o4/b-cds/sio2-mips。将此磁性分子印迹核/壳聚合物分散在溶液中制备分散液备用。

(4)在室温和磁力搅拌下，向聚合物分散液中加入一定量的藻红蛋白形成均质混合液，在避光处孵化5min后，测定不同藻红蛋白浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合藻红蛋白与b-cds的荧光发射峰强度比率(i藻红蛋白/ib-cds)与藻红蛋白摩尔浓度之间的线性关系，构建藻红蛋白比率荧光传感器。

步骤(1)中所述的氨基化蓝荧光发射b-cds，其尺寸为1～5nm；

步骤(2)中所述的羧基化fe3o4磁性纳米粒，其尺寸为10～30nm；

步骤(3)中所述的b-cds质量浓度为1～10mgml^-1；fe3o4磁性纳米粒质量浓度为5～20mgml^-1；藻红蛋白的用量为0.5～1μm；

步骤(4)中所述的藻红蛋白摩尔浓度的线性检测范围为1～500nm，检测极限为1～10纳摩尔/升。

本发明的效果是：报道了一种新颖的基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器。以fe3o4磁性纳米粒为中心，在其表面偶联蓝荧光发射的碳量子点(b-cds)，在fe3o4/b-cds表面生长负载了模板分子(藻红蛋白)的二氧化硅壳层，洗脱模板分子制得分子印迹聚合物sio2-mips，即制得fe3o4/b-cds/sio2-mips磁性分子印迹核/壳聚合物。测定不同藻红蛋白浓度下该聚合物均质混合液的荧光发射光谱，拟合藻红蛋白与b-cds的荧光发射峰强度比率(i藻红蛋白/ib-cds)与藻红蛋白摩尔浓度之间的线性关系，构建藻红蛋白比率荧光传感器，用于高灵敏和高选择性比率荧光检测藻红蛋白。与现有技术相比，本发明方法操作简单，成本低，原料易得，比率信号抗干扰能力强，准确性好，灵敏度和选择性高，可发展成为一种新颖的比率荧光传感器用于藻红蛋白的高效检测。

附图说明：

图1为本发明涉及的一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备与藻红蛋白检测的原理示意图；

图2为使用本发明的比率荧光传感器测定不同藻红蛋白摩尔浓度下对应的传感器体系的荧光发射光谱；

图3为不同藻红蛋白摩尔浓度下对应的藻红蛋白与b-cds荧光发射峰强度比率i藻红蛋白/ib-cds，拟合不同比率值与藻红蛋白摩尔浓度之间的线性关系。

具体实施方式：

下面结合附图并通过具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

本实施例涉及的一种基于磁性分子印迹核/壳聚合物的藻红蛋白比率荧光传感器的制备方法，其制备工艺和比率荧光检测藻红蛋白的原理示意图如图1所示，具体工艺步骤如下：

氨基化蓝荧光发射b-cds的制备：取0.3ml乙二醚和25ml儿茶酚溶液超声混匀，转入50ml聚四氟乙烯内胆的高压反应釜中，在180℃下加热反应12h，将制得的深棕色混合液用20ml二次蒸馏水稀释，以12000rpm转速离心除去较大颗粒，收集上清液并采用0.4μm微滤膜过滤，滤液采用截留分子量1000da透析袋透析处理以清除未反应实验原料，将透析袋中溶液倒出，采用旋转蒸发除去90％的液体，再真空干燥得到b-cds，在4℃避光条件下储存，或分散在溶液中制备b-cds的分散液用于后续实验，其中b-cds平均尺寸为2nm。

羧基化fe3o4磁性纳米粒的制备：向250ml反应瓶中加入摩尔比为2:1的氯化铁和氯化亚铁配成100ml混合溶液，在n2保护下向反应瓶中加入质量浓度为25％的10ml氨水，快速搅拌反应，用hcl调节溶液ph至碱性，反应10min后加入10ml柠檬酸三钠溶液，将反应瓶放置于80℃的水浴锅中继续搅拌反应30min，产物经离心，洗涤和干燥处理得到fe3o4，在4℃避光条件下储存，或分散在溶液中制备fe3o4的分散液用于后续实验，其中fe3o4平均尺寸为15nm。

磁性分子印迹核/壳聚合物的制备：取2mlb-cds水分散液加入到18ml含有0.8mlfe3o4的水分散液中，其中b-cds质量浓度为2mgml^-1，fe3o4磁性纳米粒质量浓度为10mgml^-1；搅拌反应30min后，加入模板分子藻红蛋白和20μl3-氨基丙基三乙氧基硅烷，其中藻红蛋白用量为0.5μm；继续反应1h，再加入40μl氨水和40μl硅酸四乙酯，在避光处反应12h，将产物离心，用体积比为8:2乙醇/乙腈洗涤三次，除去模板分子，产物经离心，洗涤和干燥处理得到fe3o4/b-cds/sio2-mips。将此磁性分子印迹核/壳聚合物分散在溶液中制备分散液备用。

在室温和磁力搅拌下，向聚合物分散液中加入一定量的藻红蛋白形成均质混合液，在避光处孵化5min后，测定不同藻红蛋白浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合藻红蛋白与b-cds的荧光发射峰强度比率(i藻红蛋白/ib-cds)与藻红蛋白摩尔浓度之间的线性关系，构建藻红蛋白比率荧光传感器。如图2所示，使用本发明的比率荧光传感器测定不同藻红蛋白摩尔浓度下对应的传感器体系荧光发射光谱。如图3所示，基于本发明的比率荧光传感器获得的藻红蛋白摩尔浓度的线性检测范围为5～250nm，检测极限为2nm。

实施例2：本实施例涉及的藻红蛋白比率荧光传感器的制备工艺和比率荧光检测藻红蛋白的原理示意图，氨基化蓝荧光发射b-cds和羧基化fe3o4磁性纳米粒制备的工艺步骤同实施例1，其中b-cds平均尺寸为3nm，fe3o4平均尺寸为20nm。其它具体工艺步骤如下：

磁性分子印迹核/壳聚合物的制备：取2mlb-cds水分散液加入到18ml含有0.8mlfe3o4的水分散液中，其中b-cds质量浓度为5mgml^-1，fe3o4磁性纳米粒质量浓度为15mgml^-1；搅拌反应30min后，加入模板分子藻红蛋白和20μl3-氨基丙基三乙氧基硅烷，其中藻红蛋白用量为0.8μm；继续反应1h，再加入40μl氨水和40μl硅酸四乙酯，在避光处反应12h，将产物离心，用体积比为8:2乙醇/乙腈洗涤三次，除去模板分子，产物经离心，洗涤和干燥处理得到fe3o4/b-cds/sio2-mips。将此磁性分子印迹核/壳聚合物分散在溶液中制备分散液备用。

在室温和磁力搅拌下，向聚合物分散液中加入一定量的藻红蛋白形成均质混合液，在避光处孵化5min后，测定不同藻红蛋白浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合藻红蛋白与b-cds的荧光发射峰强度比率(i藻红蛋白/ib-cds)与藻红蛋白摩尔浓度之间的线性关系，构建藻红蛋白比率荧光传感器。藻红蛋白摩尔浓度的线性检测范围为5～500nm，检测极限为5nm。

实施例3：本实施例涉及的藻红蛋白比率荧光传感器的制备工艺和比率荧光检测藻红蛋白的原理示意图，氨基化蓝荧光发射b-cds和羧基化fe3o4磁性纳米粒制备的工艺步骤同实施例1，其中b-cds平均尺寸为5nm，fe3o4平均尺寸为25nm。其它具体工艺步骤如下：

磁性分子印迹核/壳聚合物的制备：取2mlb-cds水分散液加入到18ml含有0.8mlfe3o4的水分散液中，其中b-cds质量浓度为8mgml^-1，fe3o4磁性纳米粒质量浓度为20mgml^-1；搅拌反应30min后，加入模板分子藻红蛋白和20μl3-氨基丙基三乙氧基硅烷，其中藻红蛋白用量为1μm；继续反应1h，再加入40μl氨水和40μl硅酸四乙酯，在避光处反应12h，将产物离心，用体积比为8:2乙醇/乙腈洗涤三次，除去模板分子，产物经离心，洗涤和干燥处理得到fe3o4/b-cds/sio2-mips。将此磁性分子印迹核/壳聚合物分散在溶液中制备分散液备用。

在室温和磁力搅拌下，向聚合物分散液中加入一定量的藻红蛋白形成均质混合液，在避光处孵化5min后，测定不同藻红蛋白浓度下均质混合液的荧光发射光谱，拟合藻红蛋白与b-cds的荧光发射峰强度比率(i藻红蛋白/ib-cds)与藻红蛋白摩尔浓度之间的线性关系，构建藻红蛋白比率荧光传感器。藻红蛋白摩尔浓度的线性检测范围为10～500nm，检测极限为8nm。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。