本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法。
背景技术：
1，3二磷酸甘油酸是糖酵解过程的中间代谢产物，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。
目前现有的检测1,3二磷酸甘油酸含量的方法为双抗体一步夹心酶联免疫吸附法（elisa)，但是该方法存在检测周期长，成本高，适用范围窄，稳定性差，准确度低和假阳性等缺点，这导致目前市面上还没有一种有效的利用生化法检测1,3二磷酸甘油酸含量的试剂盒及其检测方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒及其方法，具有适用范围广，操作简便，检测时间短，检测灵敏度高，成本低廉，重复性好，准确率高等特点。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体100ml×1瓶，由tris-hcl，egta，巯基乙醇，甘油混合而成，至于100ml容量瓶中，4℃保存；
试剂一，粉剂×1瓶，由半胱氨酸，mgso4.7h2o，nadh，atp，三磷酸甘油醛脱氢酶混合而成，置于30ml试剂瓶中，-20℃保存；
试剂二，液体20ml×1瓶，由tris-hcl组成，置于20ml容量瓶中，4℃保存。
进一步的，所述提取液中含有的具体组分为100ml100mmph8.2tris-hcl，38mgegta，50μl巯基乙醇和5ml甘油。
进一步的，所述试剂一中含有的具体组分为8.4mg半胱氨酸，8.4mgmgso4.7h2o，2.4mgnadh，7.2mgatp和0.5mg三磷酸甘油醛脱氢酶。
进一步的，所述试剂二中含有的具体组分为84mmph7.6tris-hcl。
一种采用上述试剂盒的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定方法，具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备分光光度计或酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤21，3二磷酸甘油酸的提取；
动植物组织：称取0.1g样本，加入1ml所述提取液，冰浴匀浆，然后设置离心率为8000g，4℃下离心10min，取上清测定；
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为（500~1000）：1的比例，超声波破碎细菌或细胞；最后设置离心率为8000g，在4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3仪器的预热和调节；
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤41，3二磷酸甘油酸含量的测定操作；
工作液的配制：将所述试剂二全部倒入所述试剂一的试剂瓶中，充分溶解，37℃或25℃预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本和190μl制备好的所述工作液，混匀，记录340nm处20s时的吸光值a1和5min20s后的吸光值a2，计算δa=a1-a2；
步骤51，3二磷酸甘油酸含量的计算；
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1）按样本蛋白浓度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/mgprot）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（v样×cpr）÷t=643×δa÷cpr；
2）按样本鲜重计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/g鲜重）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（w×v样÷v样总）÷t=643×δa÷w；
3）按细菌或细胞密度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/104cell）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（500×v样÷v样总）÷t=1.286×δa；
其中，v反总=2×10-4l，表示反应体系总体积；
ε=6.22×103l/mol/cm，表示nadh摩尔消光系数；
d=1cm，表示比色皿光径；
v样=0.01ml，表示加入样本的体积；
v样总=1ml，表示加入提取液的体积；
t=5min，表示反应时间；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示500万个细菌或细胞总数；
b.用96孔板测定的计算公式如下：
1）按样本蛋白浓度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/mgprot）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（v样×cpr）÷t=1286×δa÷cpr；
2）按样本鲜重计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/g鲜重）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（w×v样÷v样总）÷t=1286×δa÷w；
3）按细菌或细胞密度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/104cell）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（500×v样÷v样总）÷t=2.573×δa；
其中，v反总=2×10-4l，表示反应体系总体积；
ε=6.22×103l/mol/cm，表示nadh摩尔消光系数；
d=0.5cm，表示96孔板光径；
v样=0.01ml，表示加入样本的体积；
v样总=1ml，表示加入提取液的体积；
t=5min，表示反应时间；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示500万个细菌或细胞总数。
进一步的，步骤2中，收集细菌或细胞的数量为500万个，加入所述提取液的体积为1ml。
进一步的，步骤2中，超声破碎细菌或细胞的具体方法为在冰浴条件下，设置超声功率20%或200w，超声破碎3s，间歇10s，重复循环30次。
进一步的，步骤4中，用于哺乳动物样本检测的工作液的预热温度为37℃，用于除哺乳动物以外的其他物种样本检测的工作液的预热温度为25℃。
进一步的，本发明的1,3-二磷酸甘油酸含量测定方法的最低检测线为0.1nmol/mgprot。
本发明的测定原理为3磷酸甘油醛脱氢酶可逆向催化1,3二磷酸甘油酸和nadh生成3磷酸甘油醛、无机磷和nad，在反应体系中加入3磷酸甘油醛脱氢酶和nadh，340nm处测定nadh的减少量可反映1，3二磷酸甘油酸含量的高低。目前尚未发现有文献和已有发明采用此方法检测1,3二磷酸含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的检测方法适用于动物、植物、微生物和培养细胞等各种样本，与elisa只适用于哺乳动物相比，具有显著的优势。
2、本发明的检测方法最低检测限为0.1nmol/mgprot，大大提高了检测灵敏度。
3、本发明的检测方法操作简便，仅需5分钟即可完成一个样本的测定，而且该方法通过简单配制工作液，只需在96孔板中加入样本和工作液两种试剂即可完成测定，检测及其方便，大大节约了检测时间。
4、本发明的检测方法的试剂原料价格低廉，成本极低。
5、本发明的检测方法的重复性较好，变异系数(cv值)在2％以内。
6、本发明的检测方法的准确度较高，加样回收率为98%-102%。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明。本发明的具体实施方式由以下实施例详细给出。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
一种基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定试剂盒，包括以下试剂：
提取液，液体100ml×1瓶，由100ml100mmph8.2tris-hcl，38mgegta，50μl巯基乙醇，5ml甘油混合而成，至于100ml容量瓶中，4℃保存；
试剂一，粉剂×1瓶，由8.4mg半胱氨酸，8.4mgmgso4.7h2o，2.4mgnadh，7.2mgatp，0.5mg三磷酸甘油醛脱氢酶混合而成，置于30ml试剂瓶中，-20℃保存；
试剂二，液体20ml×1瓶，由84mmph7.6tris-hcl组成，置于20ml容量瓶中，4℃保存。
一种采用上述试剂盒的基于微量法的1,3-二磷酸甘油酸含量测定方法，具体步骤如下：
步骤1仪器和用品的准备；
准备分光光度计或酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿或96孔板、研钵、冰和蒸馏水；
步骤21，3二磷酸甘油酸的提取；
动植物组织：称取0.1g样本，加入1ml所述提取液，冰浴匀浆，然后设置离心率为8000g，4℃下离心10min，取上清测定；
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为（500~1000）：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200w，超声破碎3s，间隔10s，重复30次）；最后设置离心率为8000g，在4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；
步骤3仪器的预热和调节；
分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；
步骤41，3二磷酸甘油酸含量的测定操作；
工作液的配制：将所述试剂二全部倒入所述试剂一的试剂瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
在微量石英比色皿或96孔板中加入10μl样本和190μl制备好的所述工作液，混匀，记录340nm处20s时的吸光值a1和5min20s后的吸光值a2，计算δa=a1-a2；
步骤51，3二磷酸甘油酸含量的计算；
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1）按样本蛋白浓度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/mgprot）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（v样×cpr）÷t=643×δa÷cpr；
2）按样本鲜重计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/g鲜重）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（w×v样÷v样总）÷t=643×δa÷w；
3）按细菌或细胞密度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/104cell）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（500×v样÷v样总）÷t=1.286×δa；
其中，v反总=2×10-4l，表示反应体系总体积；
ε=6.22×103l/mol/cm，表示nadh摩尔消光系数；
d=1cm，表示比色皿光径；
v样=0.01ml，表示加入样本的体积；
v样总=1ml，表示加入提取液的体积；
t=5min，表示反应时间；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示500万个细菌或细胞总数；
b.用96孔板测定的计算公式如下：
1）按样本蛋白浓度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/mgprot）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（v样×cpr）÷t=1286×δa÷cpr；
2）按样本鲜重计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/g鲜重）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（w×v样÷v样总）÷t=1286×δa÷w；
3）按细菌或细胞密度计算；
1，3二磷酸甘油酸（nmol/104cell）=[δa×v反总÷（ε×d）×109]÷（500×v样÷v样总）÷t=2.573×δa；
其中，v反总=2×10-4l，表示反应体系总体积；
ε=6.22×103l/mol/cm，表示nadh摩尔消光系数；
d=0.5cm，表示96孔板光径；
v样=0.01ml，表示加入样本的体积；
v样总=1ml，表示加入提取液的体积；
t=5min，表示反应时间；
cpr表示样本蛋白质浓度，单位为mg/ml；
w表示样本质量，单位为g；
500表示500万个细菌或细胞总数。
本发明的1,3-二磷酸甘油酸含量测定方法的最低检测线为0.1nmol/mgprot。
上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。