一种苗期甘薯黑斑病精准抗性鉴定方法与流程

本发明涉及一种苗期甘薯黑斑病精准抗性鉴定方法，属于农业植保领域。

背景技术：

甘薯黑斑病(sweetpotatoblackrot)是甘薯栽培和贮藏中的主要病害之一，在世界各甘薯产区均有发生，其病原菌为甘薯长喙壳菌(ceratocystisfimbriataellisethalsted)，可为害甘薯茎、叶及块根组织，造成死苗、烂床、烂窖，对甘薯生产影响极大。被黑斑病菌侵染过的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物质，家畜食用后可引起中毒症状；用病薯作发酵原料会延缓发酵过程，降低酒精产量和质量，严重制约甘薯产业的发展。黑斑病菌可通过种薯、种苗及土壤等多种途径传播，很难彻底根除，目前生产上选育黑斑病抗病品种是主要防治途径之一。

抗病鉴定是选育抗病品种的基础，目前生产上采用蘸孢子液针刺薯块接种法和孢子液侵染薯苗法进行甘薯品种黑斑病抗病鉴定，其中采用蘸孢子液针刺薯块接种法进行抗病鉴定大约需要11d，每天换纱布进行保湿，在此过程中湿度过小黑斑病不易发生，湿度过大薯块长时间处于高湿状态非常容易被杂菌污染且薯块容易腐烂，严重影响抗病鉴定结果；采用孢子液侵染薯苗法大约需要5-7d，薯苗茎秆长时间浸泡在液体中极易腐烂，对抗病鉴定结果造成较大影响。因此，应用这两种方法进行甘薯黑斑病抗性鉴定均有所欠缺。

因此，建立一种甘薯黑斑病精准抗性鉴定方法，是本领域亟待解决的技术问题，也是甘薯黑斑病抗病育种的重要条件，而目前国内外尚未见相关研究报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种苗期甘薯黑斑病精准抗性鉴定方法，该方法操作简单，科学高效。

为了实现上述目的，本发明采用一种苗期甘薯黑斑病精准抗性鉴定方法，包括以下步骤：

1)病菌分离与活化：从田间采集发病薯块，用组织分离法和单孢分离法分离纯化甘薯黑斑病菌，并经科赫式法则验证后，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养7天，备用；

2)ps培养液的制备：称取马铃薯20g加入1l超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15g蔗糖，加超纯水定容至1l，每个三角瓶分装30ml，然后于121℃高压灭菌15min备用；

3)病原菌的摇培：取出活化好的甘薯黑斑病菌，用直径为6mm的打孔器打取菌碟，每个三角瓶中接种20个菌碟，将接种好的三角瓶置于28℃恒温摇床中，于120rpm/min摇培48h；

4)黑斑病菌孢子悬浮液的制备：采用滤纸过滤收集滤液，显微镜下观察并调节孢子悬浮液浓度为1×10⁵cfu/ml；

5)参试薯苗准备和接种：从甘薯储藏库取甘薯品种，每个3块，置于装土的盆钵中催芽，待发芽后每个品种剪取3棵生长一致的甘薯幼苗，分别种植在装灭菌土的盆钵中，将制备好的孢子悬浮液进行灌根处理，每个盆钵灌根量为50ml，之后每3天用灭菌水均匀喷雾；

6)调查评价：接种15天后调查薯苗黑斑病发病情况，并根据病情指数分级标准将薯苗分为0、1、3、5、7、9级，共6个等级，根据平均病情指数将品种对黑斑病的抗性分为抗病、中抗、感病和高感四个级别；平均病情指数＝(重复1病情指数+重复2病情指数+重复3病情指数)/3；苗期甘薯黑斑病抗性水平按照以下标准进行确定：

抗病：平均病情指数≤2.0；

中抗：2.0＜平均病情指数≤4.0；

感病：4.0＜平均病情指数≤6.0；

高感：平均病情指数＞6.0；

所述的分级标准是：

0级：整株健康无病症；

1级：植株正常生根，地下部茎有零星黑斑，茎基部叶片发黄或有萎蔫，地上部正常分枝生长；

3级：植株生根但根系较少，地下部茎有连片黑斑，茎基部叶片发黄，薯苗生长缓慢；

5级：植株不生根，地下部茎有连片黑斑，茎基部叶片发黄，薯苗完全不分枝；

7级：地下部坏死腐烂，整株叶片发黄，植株萎蔫；

9级：地下部坏死腐烂，薯苗心叶腐烂，整株死亡。

本发明的有益效果是：

1、该方法科学快速、步骤简单易于操作，仅需要培养皿、培养箱、超净工作台、塑料盆钵等常规仪器耗材，各育种单位均能开展鉴定工作。

2、本发明采用黑斑病菌孢子悬浮液灌根接种进行鉴定，抗感表型直观，避免了蘸孢子液针刺薯块接种法中，薯肉为紫薯的情况下不便观察和测量黑斑横纵直径的问题，鉴定结果更加可靠。

3、本发明采用黑斑病菌孢子悬浮液灌根接种鉴定，接近于田间甘薯幼苗感染黑斑病的实际情况，鉴定结果更加精准可靠；同时该方法避免了蘸孢子液针刺薯块接种法和孢子液侵染薯苗法，鉴定过程中薯块和薯苗容易腐烂的问题。该方法的推广使用，对于早期大量快速筛选抗病材料和指导甘薯抗病育种具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明采用黑斑病菌孢子悬浮液灌根进行苗期抗性鉴定的流程图；

其中，a图为活化好的黑斑病菌；b图为制备好的ps液体培养基；c图是用直径为6mm的打孔器打取菌碟备用；d图为接种20个菌碟至ps培养基中；e图为28℃、120rpm/min摇培48h后得到的混合液；f图为采用滤纸过滤收集孢子液的操作；g图为经滤纸过滤收集并稀释到相应浓度的孢子悬浮液；h图为移摘灌根后的各个品种的甘薯苗。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

如图1所示，一种苗期甘薯黑斑病精准抗性鉴定方法，具体包括以下步骤：

1)病菌分离与活化：从田间采集发病薯块，用组织分离法和单孢分离法分离纯化甘薯黑斑病菌，并经科赫式法则验证后，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，培养7天，备用；

2)ps培养液的制备：称取马铃薯20g加入1l超纯水煮沸至马铃薯完全烂软，纱布过滤后加入15g蔗糖，加超纯水定容至1l，每个三角瓶分装30ml，然后于121℃高压灭菌15min备用；

3)病原菌的摇培：取出活化好的甘薯黑斑病菌，用直径为6mm的打孔器打取菌碟，每个三角瓶中接种20个菌碟，将接种好的三角瓶置于28℃恒温摇床中，于120rpm/min摇培48h；

4)黑斑病菌孢子悬浮液的制备：采用滤纸过滤收集滤液，显微镜下观察并调节孢子悬浮液浓度约为1×10⁵cfu/ml；

5)参试薯苗准备和接种：12个参试品种分别为c1：南京92；c2：冀982；c3：烟25；c4：济26；c5：sq16；c6：广87；c7：苏16；c8：运薯66；c9：龙9；c10：商19；c11：胜利百号；c12：徐薯29，从甘薯储藏库取各甘薯品种，每个3块，置于装土的盆钵中催芽，待发芽后每个品种剪取3棵生长一致的甘薯幼苗，分别种植在装灭菌土的盆钵中，将制备好的孢子悬浮液进行灌根处理每个盆钵灌根量为50ml，之后每3天用灭菌水均匀喷雾；

6)调查评价：接种15天后调查薯苗黑斑病发病情况，并根据病情指数分级标准将薯苗分为0、1、3、5、7、9级，共6个等级，根据平均病情指数将品种对黑斑病的抗性分为抗病、中抗、感病和高感四个级别；平均病情指数＝(重复1病情指数+重复2病情指数+重复3病情指数)/3；苗期甘薯黑斑病抗性水平按照以下标准进行确定：

抗病：平均病情指数≤2.0；

中抗：2.0＜平均病情指数≤4.0；

感病：4.0＜平均病情指数≤6.0；

高感：平均病情指数＞6.0；

所述的分级标准是：

0级：整株健康无病症；

1级：植株正常生根，地下部茎有零星黑斑，茎基部叶片发黄或有萎蔫，地上部正常分枝生长；

3级：植株生根但根系较少，地下部茎有连片黑斑，茎基部叶片发黄，薯苗生长缓慢；

5级：植株不生根，地下部茎有连片黑斑，茎基部叶片发黄，薯苗完全不分枝；

7级：地下部坏死腐烂，整株叶片发黄，植株萎蔫；

9级：地下部坏死腐烂，薯苗心叶腐烂，整株死亡。

各品种抗病鉴定结果如表1所示。

表1甘薯苗期黑斑病抗性鉴定结果

从表1可以看出，采用本发明方法所鉴定的12个甘薯品种中，南京92等共1个品种(系)薯苗对黑斑病的抗性级别为“抗病”；冀982等1个品种(系)薯苗对黑斑病的抗性级别为“中抗”；烟25、广87、苏16、运薯66和龙9等共5个品种薯苗黑斑病的抗性级别为“感病”；济26、sq16、商19、胜利百号和徐薯29等共5个品种薯苗黑斑病的抗性级别为“高感”。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。