一种通过鱼类实验确定酒中关键上头物质的方法与流程

本发明涉及一种通过鱼类实验确定酒中关键上头物质的方法，属于检测技术领域。

背景技术：

饮用舒适度是影响酒类消费的一个重要因素，其主要表现在饮后醉酒程度，即上头深醉。随着生活水平的不断提升，人们对饮酒后的舒适性要求越来越高。包括白酒、黄酒及红酒等在内，饮后上头深醉已经成为影响酒类品质及其行业发展的桎梏，因此提高酒类饮用舒适度显得愈发必要。然而要调控其饮用舒适度，则要先明确影响饮用舒适度的关键物质。一些报道称酒中高级醇、生物胺和醛类等是导致饮酒上头深醉的主要物质。关于这些化合物毒性相关的研究已有诸多报道；但是关于它们在酒中对舒适度的影响的报道十分稀少，更没有确切的方法体系来证实这些物质在酒中是否真的会引起上头深醉亦或对醉酒贡献的大小。这就导致消费者及生产者对酒中上头物质的了解十分模糊，使得生产者对酒品质及饮用舒适性的调控缺乏明确的目标。因此，寻找一种能准确找出影响上头关键化合物的方法就显得尤为重要。

鱼类实验模型在各研究领域的应用已十分广泛。鱼类具有典型的脊椎动物脑部特征，神经行为遵循顺序发育原则，与其它动物模型相比，它具有饲养经济，易获得足够样本量，易于观察，体型小，操作方便，实验结果比较客观等优点。包括鲫鱼、锦鲤、斑马鱼、罗非鱼等，鱼类已广泛应用于毒性评价等研究领域。并且乙醇等物质引起鱼类行为学异常、肠道生化指标及微生物组变化的相关研究已有报道，鱼类实验模型也越来越受研究者的青睐。

技术实现要素：

为了准确找出影响上头关键化合物，本发明基于鱼类实验模型，提供了一种通过鱼类醉酒实验准确找出酒中引起上头深醉的关键化合物的方法，以期为提高酒的品质和饮用舒适度提供可靠依据

本发明的第一个目的在于提供一种确定酒中关键上头物质的鱼类模型的构建方法，所述方法包括如下步骤：

1)实验鱼类在适宜水体中自由饮水进食，适应性喂养2周后进行试验，按照体重随机分组；

2)将一部分组的鱼类分别暴露于添加不同类型上头物质混合物的乙醇溶液中进行试验，一部分组的鱼类分别暴露于添加不同类型上头物质单体物质的乙醇溶液中进行试验，一部分组的鱼类分别暴露于添加缺失某一种单体物质的各类上头物质混合物的乙醇溶液中进行试验，还有一组实验鱼类使用无添加的乙醇溶液作为对照；

3)观测醉酒行为，记录醉酒时间。

在本发明的一种实施方式中，所述方法中的乙醇溶液的乙醇浓度为1.6％-2％。

在本发明的一种实施方式中，所述上头物质混合物是高级醇混合物、生物胺混合物和醛混合物的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述上头物质混合物中的高级醇混合物的总质量浓度不低于280mg/l。

在本发明的一种实施方式中，所述上头物质混合物中的生物胺混合物的总质量浓度不低于50mg/l。

在本发明的一种实施方式中，所述上头物质单体物质选用高级醇中的正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、β-苯乙醇和2,3-丁二醇。

在本发明的一种实施方式中，所述上头物质单体物质包括生物胺中的组胺、腐胺、酪胺、尸胺、色胺、精胺、亚精胺和β-苯乙胺。

在本发明的一种实施方式中，所述上头物质单体物质包括醛中的乙醛、5-羟甲基糠醛、糠醛、苯甲醛、苯乙醛、正戊醛。

在本发明的一种实施方式中，所述实验对象为锦鲤鱼(cryprinuscarpiod)或鲫鱼(carassiusauratus)，体长12-15cm，年龄1年左右。

在本发明的一种实施方式中，所述水体为曝气3d的无氯自来水，水温为20-30℃，ph6.8-7.2，do保持在5mg/l以上，每天光照12-16h，每3天换水一次；每天投食2次。

在本发明的一种实施方式中，所述醉酒行为为侧翻、身体失去平衡、左右摇摆，醉酒时间为鱼从暴露于溶液到发生醉酒行为的时间。

在本发明的实施方式中，所述方法具体是：

(1)实验对象的选择：选取体质健康、活泼无病的鱼；

(2)适应环境：实验前适应环境2周；

(3)溶液配制：按照酒中物质正常浓度配制所需乙醇溶液；

(4)暴露实验：随机选取已适应环境的鱼于装有配置好的实验溶液的烧杯中；

(5)观测醉酒行为，记录醉酒时间。

在本发明的实施方式中，所述步骤(4)和(5)中暴露实验包括混合溶液暴露实验、单体物质暴露实验及单体物质缺失实验，以无添加的乙醇溶液为对照。

在本发明的一种实施方式中，实验容器为5l玻璃烧杯，实验用鱼为随机选取，每组实验设置3个平行，每个平行用鱼数量大于5条。

在本发明的一种实施方式中，所述醉酒行为为侧翻、身体失去平衡、左右摇摆，醉酒时间为鱼从暴露于溶液到发生醉酒行为的时间。

本发明的第二个目的在于将所述方法应用于确定酒中关键上头物质中。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种确定酒中关键上头物质的鱼类模型的构建方法，通过混合溶液暴露实验、单体物质暴露实验及单体物质缺失实验，混合溶液暴露实验、单体物质暴露实验所用醉酒时间越短，证明该物质对上头贡献越大，单体物质缺失实验所用醉酒时间越短，证明该物质对上头贡献越小。观测实验对象在其中的醉酒行为和时间，以酒中确定引起饮酒上头的关键物质，并得到各上头物质的作用贡献大小。本发明方法简单、易操作，检测效率高，几小时内即可得出酒中关键上头物质，数据可靠。

附图说明

图1：不同浓度乙醇溶液对锦鲤鱼醉酒时间的影响；

图2：高级醇、生物胺、醛混合溶液分别对锦鲤鱼醉酒时间的影响；

图3：单体物质暴露对锦鲤鱼醉酒时间的影响；

图4：单体物质缺失暴露对锦鲤鱼醉酒时间的影响；

图5：不同高级醇浓度对锦鲤鱼醉酒时间的影响；

图6：不同生物胺浓度对锦鲤鱼醉酒时间的影响。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1确认酒中关键上头物质

高级醇、生物胺、醛混合物对锦鲤鱼醉酒时间的影响：

锦鲤鱼为实验对象，按照表1、2和3中的高级醇、生物胺、醛类各物质浓度配制乙醇溶液并进行暴露实验，来确定酒中关键上头物质；以不添加上述物质的乙醇溶液为对照。

(1)按表1、2和3所示各物质浓度分别配制高级醇、生物胺、醛类混合物溶液，各取3l分别于5l烧杯中，每种物质3个平行；

(2)随机选取已适应环境，健康、无疾病的锦鲤鱼暴露于三种溶液，以浓度为1.6％的乙醇溶液为对照；

(3)观测锦鲤鱼在不同溶液中的醉酒行为和时间。

表1高级醇混合溶液中各物质浓度

表2生物胺混合溶液中各物质浓度

表3醛混合溶液中各物质浓度

结果如图2所示，暴露于高级醇、生物胺、醛混合溶液中的锦鲤鱼，醉酒时间各不相同，分别为7.4±0.97、10.1±1.56及14±2.02min，而暴露于3种物质的混合溶液后醉酒时间为7±1.79min，而暴露于三种混合溶液后的醉酒时间与暴露于高级醇溶液的醉酒时间相近，因此发现高级醇对醉酒的贡献最大，生物胺次之。

高级醇、生物胺、醛单体物质对锦鲤鱼醉酒时间的影响：

(1)按表1、2和3所示各物质浓度分别配制高级醇、生物胺、醛单体物质溶液，各取3l分别于5l烧杯中，每种化合物3个平行；

(2)随机选取已适应环境，健康、无疾病的锦鲤鱼暴露于三种溶液，以浓度为1.6％的乙醇溶液为对照；

(3)观测锦鲤鱼在不同溶液中的醉酒行为和时间。

结果如图3所示，暴露于各种单体物质后，锦鲤鱼醉酒时间各不相同，高级醇溶液中，β-苯乙醇和异戊醇对醉酒贡献最大，醉酒时间分别为13.3±5.07和17.6±4.39min；生物胺中β-苯乙胺和组胺是影响锦鲤鱼醉酒时间的两种主要物质，醉酒时间分别为20.21±2.29和21±3.11min；然而多数醛类与乙醇起到拮抗作用，使锦鲤鱼醉酒时间延后。因此单体物质暴露实验发现高级醇和生物胺中影响醉酒的两种主要物质，主要化合物分别是β-苯乙醇、异戊醇和β-苯乙胺、组胺。

高级醇、生物胺、醛单体物质缺失对锦鲤鱼醉酒时间的影响：

(1)按表1、2和3所示各物质浓度分别配制缺失一种单体物质的高级醇、生物胺、醛溶液，各取3l分别于5l烧杯中，每种化合物3个平行；

(2)随机选取已适应环境，健康、无疾病的锦鲤鱼暴露于三种溶液，以浓度为1.6％的乙醇溶液为对照；

(3)观测锦鲤鱼在缺失一种单体物质溶液中的醉酒行为和时间。

结果如图4所示，缺失实验同样证明高级醇溶液中，β-和异戊醇对醉酒贡献最大；生物胺中β-苯乙胺和组胺是影响锦鲤鱼醉酒时间的两种主要物质，醛类对醉酒基本无影响。

通过单体物质复配及缺失，对锦鲤鱼醉酒时间的影响，综合上述结果发现黄酒中影响醉酒的主要是高级醇和生物胺这两类物质。高级醇对醉酒的贡献最大，生物胺次之，醛类对醉酒基本无贡献；而高级醇和生物胺中影响醉酒的关键化合物分别是高级醇中的β-苯乙醇、异戊醇，和生物胺中的β-苯乙胺、组胺。

实施例2考察乙醇浓度对检测效果的影响

(1)分别配制浓度为0.6％、1.0％、1.6％、1.8％、2.0％的乙醇溶液，各取3l分别于5l烧杯中，每个梯度3个平行，每个平行用鱼数量大于5条；

(2)选择曝气3d的无氯自来水、水温为20℃、ph7.0±0.2、do保持在5mg/l以上的水体作为培养环境，每天光照12-16h，每3天换水一次；每天投食2次。

(3)随机选取已适应环境，健康、无疾病的锦鲤鱼和鲫鱼分别暴露于不同浓度乙醇溶液；

(4)观测锦鲤鱼在不同浓度乙醇溶液中的醉酒行为和时间。

当乙醇浓度为0.6％，锦鲤鱼超过3h不醉酒，如图1所示，1.0％乙醇浓度时各平行实验中的醉酒时间差距较大；因此，乙醇浓度为1.6％-2.0％时，锦鲤鱼醉酒时间更具有统计学意义，平行性好，且时间维持在30min以内，在此基础上实验时间更易控制。

实施例3考察高级醇、生物胺浓度对检测效果的影响

按照表4、5所示高级醇、生物胺、醛混合溶液中各物质浓度配置物质溶液，其他条件参照实施例1，分别进行不同浓度高级醇、生物胺、醛混合物对锦鲤鱼醉酒时间的影响研究、高级醇、生物胺、醛单体物质对锦鲤鱼醉酒时间的影响研究和高级醇、生物胺、醛单体物质缺失对锦鲤鱼醉酒时间的影响研究。

表4高级醇混合溶液中各物质浓度(mg/l)

表5生物胺混合溶液中各物质浓度(mg/l)

结果如图5、6所示，按照浓度从小到大，依次做醉酒行为分析，发现当配制溶液中高级醇、生物胺浓度分别为56.16～280.80和10.26～51.34mg/l时，不同浓度之间对醉酒时间的影响差异较小，尤其是当高级醇和生物胺浓度分别低于280.8和51.34mg/l时，各浓度物质不能明显区分其对锦鲤鱼醉酒时间的影响，无法用于关键性分析；而当浓度大于该值时，各物质对醉酒时间的影响与其浓度呈良好线性关系，且平行性好。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。