PL2L60蛋白在制备早期筛查或诊断肿瘤试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于生物医学检测领域，涉及pl2l60蛋白作为肿瘤标记物的应用，具体涉及pl2l60蛋白抗体制备早期筛查或诊断肿瘤试剂盒中的应用。

背景技术：

目前，免疫疗法是探索肿瘤治疗新方法的热点。越来越多的证据表明，要治愈肿瘤需要免疫疗法的配合。免疫疗法主要包括抗体介导的被动免疫疗法和以激活肿瘤特异性免疫细胞为特征的主动免疫疗法。主动免疫疗法可以包括：(1)特异性肿瘤疫苗，(2)免疫生物调节剂(immunomodulators)和(3)免疫细胞疗法。目前，临床上免疫疗法比较成功的是以pd-1为靶标的抗体药。其它疗法如免疫细胞疗法等不尽人意。即使cart疗法，也只能是肿瘤免疫治疗的过渡性方案。

但是，以pd-1为靶标的免疫疗法有很大的局限性。开始认为抗pd-1抗体阻断抗肿瘤免疫反应中的免疫检查点，可以激活抗肿瘤免疫系统。实践证明，这一假设不成立。事实是，抗pd-1抗体是通过直接识别肿瘤细胞表面表达pd-1，激活adcc通路而直接杀伤肿瘤细胞，而不是通过阻断pd-1/pd-l1免疫抑制点起作用。由于多数肿瘤不表达pd-1，故抗pd-1抗体药的应用受到很大的限制。此外，2010年4月29日fda批准的唯一的一个用于治疗晚期前列腺癌的肿瘤疫苗(实为免疫细胞)产品provenge(sipuleucelt)由于其临床效果差而面临失败。总之，由于缺乏肿瘤特异性地广谱肿瘤抗原，无论被动免疫治疗还是主动免疫治疗都遭遇目前难以逾越的瓶颈。

要克服目前免疫疗法的瓶颈，需要找到既有肿瘤特异性又有肿瘤广谱性的肿瘤生物标志物(tumor-specificantigen；tsa)。目前，国内外药企正在研发的肿瘤靶标一般不具有肿瘤特异性和肿瘤广谱性，所以，难以在肿瘤免疫治疗方面有里程碑式的突破。目前，肿瘤免疫治疗的突破需要克服以下几个瓶颈：

(1)需要肿瘤特异性和广谱性的靶标(tsa)，特别是这些靶标可表达在肿瘤干/祖细胞；

(2)制备相应高效细胞毒性抗体(被动免疫治疗)；

(3)具有不受mhc约束并可被抗原递呈细胞(apc)有效递呈的多肽序列；

(4)具有培养、扩增免疫功能正常(immunocmpetent)且不产生免疫耐受(immunotolerant)的免疫细胞的技术，包括树突状细胞(dendriticcell；dc)和杀伤细胞(killer)。

如果克服这些瓶颈，肿瘤免疫治疗的时代才会真正到来。但现有技术中，尚无文献对能够在多种肿瘤中特异性表达的基因或蛋白进行记载。

技术实现要素：

本发明的发明人通过多年潜心研究发现和鉴定了肿瘤干/祖细胞特异性蛋白pl2l60，它是新型肿瘤干细胞标志物。另外，制备了高效抗pl2l60抗体，从pl2l60蛋白筛选了具有较强免疫原性的多肽，并在动物试验中证实pl2l60是肿瘤免疫治疗的重要靶标。基于pl2l60的肿瘤免疫治疗方案可以突破当前免疫治疗的瓶颈，有效解决上述问题。

pl2l60是生殖干细胞基因piwil2在肿瘤中异化激活的产物piwil2一般表达在生殖干细胞中，在精子生成过程中，通过piwi-pirna通路参与细胞核重编程或染色质重塑(chromatinremodeling)；还可通过dna甲基化调节反转录转座子的活性。但是，正常情况下在体细胞中不表达。当体细胞暴露在致癌坏境中，dna受损，piwil2基因就会被激活，参与dna损伤的修复，但是，过表达piwil2会诱导肿瘤细胞凋亡。因此，piwil2具有肿瘤屏障基因(tbg)的功能。

但是，在致癌环境下，当piwil2基因内启动子被激活，产生异化激活的蛋白如pl2l60。pl2l60在正常细胞中不表达，主要在转化细胞和肿瘤干/祖细胞中表达，促进肿瘤的发生发展。肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的种子细胞，抑制肿瘤干细胞就可以达到抑制甚至治愈肿瘤的目的。

肿瘤干细胞可以从正常细胞转化成肿瘤起始干细胞(tic)，经过癌前干细胞(pcsc)和癌症干细胞(csc)发展为癌症祖细胞(cpc)，后者成为肿瘤发展的主要种子细胞。pl2l60在癌前干细胞、癌症干细胞、癌症祖细胞和肿瘤细胞株中均有表达，其表达水平与肿瘤细胞增殖能力正相关。更重要的是，pl2l60表达在各种血液肿瘤和实体瘤中，具有肿瘤特异性和广谱性。以pl2l60为靶标设计的免疫治疗方案，可以有效地防治各种血癌和实体瘤。

pl2l60在癌前干细胞中高水平表达，是自然抗肿瘤免疫(nati)的有效靶标。抗pl2l60单抗可同时识别人和小鼠的pl2l60，用抗pl2l60的单抗(kao2和kao3克隆)处理癌前干细胞可以有效阻断其在免疫缺陷小鼠中的致瘤能力，所以，从小鼠获得的结果很容易在人重复。最近，我们发现除细胞浆内，pl2l60也可以在部分肿瘤细胞株的表面表达，经鉴定，这些细胞表面表达pl2l60的肿瘤细胞具有肿瘤干/祖细胞的性质，提示单抗kao2和kao3对肿瘤的抑制作用可通过靶向肿瘤干/祖细胞起作用。

癌前干细胞可以诱导自然抗肿瘤免疫，抑制癌前干细胞自身的致瘤作用。这种功能是免疫系统通过靶向癌前干细胞表达的pl2l60而发挥作用的，因为用pl2l60多肽致敏树突状细胞(dc-pl2l肿瘤疫苗)，可以激活抗肿瘤免疫，获得与癌前干细胞诱导的抗肿瘤免疫一样的效果。

因此，pl2l60蛋白具备作为肿瘤标记物和肿瘤靶标的潜力。

本发明的目的在于提供pl2l60蛋白作为肿瘤的分子标记物的应用，具体在于pl2l60蛋白在制备早期筛查或诊断肿瘤试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第一方面在于提供pl2l60蛋白在制备早期筛查或诊断肿瘤试剂或试剂盒中的应用。

所述的筛查或诊断肿瘤试剂指的是筛查或诊断肿瘤干细胞或肿瘤祖细胞的试剂。

所述的试剂盒中包括筛查或诊断肿瘤干细胞或肿瘤祖细胞的试剂。

所述的肿瘤是指白血病、淋巴癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌或肝癌。

进一步，在本发明提供的pl2l60蛋白在制备早期筛查或诊断brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用中，所述的试剂包括pl2l60蛋白抗体以及对pl2l60蛋白的表达量进行定量或半定量检测的试剂，所述的试剂盒中包括pl2l60蛋白抗体以及对pl2l60蛋白的表达量进行定量或半定量检测的试剂。

优选的，抗pl2l60蛋白抗体为kao3单克隆抗体，kao3单克隆抗体序列如seqidno:1所示。

发明的作用与效果

本发明通过大量实验证实了pl2l60蛋白在正常细胞中不表达，主要在转化细胞和肿瘤干/祖细胞中表达，促进肿瘤的发生发展，而肿瘤干细胞或肿瘤祖细胞是肿瘤发生发展的种子细胞，通过检测pl2l60蛋白的表达量，就可能够实现对早期肿瘤的诊断，通过pl2l60蛋白抗体抑制肿瘤干细胞就可以达到抑制甚至治愈肿瘤的目的。

此外，研究结果表明，pl2l60蛋白具有肿瘤特异性和肿瘤广谱性，尤其在肿瘤干/祖细胞表面的特异性表达，以pl2l60为靶标，不但可以研发高效抗体药、细胞治疗技术和肿瘤疫苗，而且可以研发出肿瘤早期诊断试剂，为肿瘤诊断和治疗的进步作出贡献，有利于推动临床肿瘤免疫治疗，具有广阔的临床应用前景。

附图说明

图1为piwil2基因内启动激活及其产物图解，(a)为piwil2基因的表达；(b)为mrna的表达；(c)为蛋白质的表达；

图2为pl2l60蛋白与piwil2基因表达差异比较；

图3为pl2l60蛋白在人和小鼠的各种白血病和肿瘤细胞株中高表达结果；

图4为pl2l60蛋白在肿瘤细胞膜表面的表达结果；

图5为kao3+细胞表面表达pl2l60结果；

图6为kao3+细胞与kao3-细胞致瘤能力比较结果；

图7为pl2l60蛋白过表达与kao3+肿瘤细胞数量关系图；

图8为pl2l60蛋白提高肿瘤细胞增殖和迁移能力验证结果；

图9为pl2l60蛋白提高肿瘤细胞致瘤能力验证图；

图10为癌前干细胞诱导自然肿瘤免疫(naturallyoccurringtumorimmunity；noti)结果；

图11为诱导noti是癌前干细胞特有的功能结果图；

图12为癌前干细胞诱导的noti是非组织特异性的结果图；

图13为dc-pl2l疫苗诱导高效抗肿瘤免疫，抑制肺转移癌结果图；

图14为pl2l60单抗(kao2)有效地抑制肿瘤细胞成瘤和转移结果图；

图15为pl2l60单抗(kao3)处理人和小鼠肿瘤能有效地抑制各种肿瘤生长结果图；

图16为kao3抗体诱导肿瘤细胞凋亡结果图；

图17为kao3单抗激活人补体杀死人和小鼠肿瘤细胞结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，物质的百分比和份数均按体积计算。

本发明中所用的材料如下：

严重联合免疫缺陷(scid)小鼠：使用8～12周的小鼠，这些小鼠被饲养在动物无害化设施中。

人类细胞系：人乳腺癌细胞系mda-mb-231，人肺癌细胞系a549和人宫颈癌细胞系hela均获自美国典型培养物保藏中心(atcc,manassas,va,usa)。将细胞保持在补充有10％胎牛血清(gibco)和0.1mg/ml青霉素-链霉素(gibco)的dmem(gibco)中。

小鼠淋巴瘤细胞系2c4和326t-4在实验室中自行制备：将细胞放置在含有5％co2(v/v)的加湿培养箱中，在37℃下保持在r10f(rpmi1640加10mmol/l胎牛血清，补充有5mmol/l谷氨酰胺，50mmol/l2-甲基苯乙酮，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素)内。

抗pl2l60单克隆抗体(kao3mab，同种型igm))按照单克隆抗体的常规制备流程在实验室中自行制备，序列如seqidno:1所示。

以下对本发明所用到的分析方法以及实验结果进行详细说明。

(一)pl2l60蛋白表达具有肿瘤特异性和肿瘤广谱性

如图1所示，piwil2基因内有多个启动子，在体细胞内通常静默，在肿瘤细胞内可被激活。其中pl2l60蛋白是肿瘤细胞内piwil2基因异化激活的主要产物。

pl2l60蛋白表达具有肿瘤特异性如图2所示，(a)显示了pl2l60特异性单克隆抗体可以识别睾丸(小鼠)和肿瘤细胞(人)中的piwil2和pl2l蛋白质：kao1主要识别睾丸中的piwil2；kao2和kao3可识别睾丸中的piwil2和pl2l40以及人肿瘤细胞(sw480)中的pl2l60和pl2l50；piwil2在肿瘤细胞中表达水平很低。

(b)显示了原发性乳腺癌(1-2)和宫颈癌(3-4)组织中表达高水平pl2l蛋白(2,4)，piwil2仅在少数凋亡细胞中表达(1,3；箭头所指)。

(c)显示了在乳腺组织(1-2)和淋巴结(3-4)转移癌中，piwil2不表达(1，箭头所指)或仅表达在少量凋亡细胞中(3，箭头所指)，但是，pl2l60几乎表达在所有的转移癌细胞中(2,4)。

(d)显示了pl2l60+细胞同时表达nf-kb：(1)pl2l60单染；(2)nf-kb单染；(3)pl2l60和nf-kb双染；(4)为图(3)方块中细胞放大后，箭头所指为pl2l60和nf-kb双阳性细胞。

pl2l60蛋白表达的肿瘤光谱性如图3所示，图3(a)～图3(d)分别显示了pl2l60蛋白在人和小鼠的各种白血病和肿瘤细胞株中的表达结果，这些细胞株包括白血病细胞、淋巴瘤、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等。hlmvec-svandhlvec-pri为早期转化细胞用作阴性对照。所有细胞株中，piwil2的水平极低，提示仅仅在少数凋亡细胞中表达，与图2结果一致。结果证实pl2l60表达具有肿瘤特异性和肿瘤广谱性。

(二)pl2l60促进肿瘤干细胞发生发展

细胞膜表达pl2l60的肿瘤细胞具有干细胞的特征。kao3+细胞具有较强的致瘤能力，过表达pl2l60的肿瘤细胞，kao3+细胞增加，增殖能力提高，侵袭、迁移和球状体生成能力增强，这些特征均与肿瘤干细胞有关。结果表明pl2l60+cd44+肿瘤细胞具有干细胞的特征，它可以促进肿瘤干细胞发生发展。具体实验验证结果如图4～图9所示：

图4显示了pl2l60蛋白在肿瘤细胞膜表面的表达结果。通常，pl2l60认为表达在细胞浆或细胞核内，但发明人最近发现，部分肿瘤细胞膜表面也表达pl2l60，并分别采用流式细胞分析技术、免疫荧光显微技术以及免疫印迹技术(wb)进行验证：(a)流式细胞分析技术显示人(mba-231，hela和a549)和小鼠(2c4和326t-4)肿瘤细胞表面也表达pl2l60(kao3+)；(b-c)免疫荧光显微技术证实肿瘤细胞表面(surface)表达pl2l60。注意：细胞内kao3+细胞(c)多于细胞膜kao3+细胞(b)；(d-e)免疫印迹技术(wb)证明小鼠(d)和人(e)各种肿瘤细胞都表达pl2l60；(f-g)为图d&e的半定量分析结果。

此后，用流式细胞分离技术分离kao3+和kao3-乳腺癌细胞(mba-md231)，分离细胞膜进行免疫印迹技术分析，结果如图5所示，证实kao3+细胞膜内含有pl2l60蛋白，验证了kao3+细胞表面表达pl2l60。

图6显示了kao3+细胞与kao3-细胞致瘤能力比较结果。从小鼠(a)肿瘤细胞(b16：黑色素瘤；el-4：淋巴瘤；llc：肺癌)和人(b)肿瘤细胞(mda-mb-231:乳腺癌；a549：肺癌；hela:宫颈癌)分离细胞表面kao3+和kao3-的细胞，接种到小鼠肿瘤细胞到免疫功能正常的b6小鼠和人肿瘤细胞到免疫功能缺陷的裸鼠。定期观察和检测肿瘤大小。结果表明：kao3+肿瘤细胞的致瘤能力高于kao3-的肿瘤细胞。与体内实验相反，kao3+细胞在体外培养不易成活，提示像干细胞一样，kao3+肿瘤细胞需要合适的壁龛(niche)才能成活。

图7为pl2l60蛋白过表达与kao3+肿瘤细胞数量关系图，显示pl2l60过表达增加kao3+肿瘤细胞，促进细胞增殖：(a)将pl2l60基因(gtx-920)稳定转入人乳腺癌肿瘤细胞(mda-mb-231和mcf-7)中，对照组转入gfp基因。结果表明转入pl2l60基因的细胞中，具有肿瘤干细胞特征的kao3+细胞增加一倍。(b)将sirna-e7和sirna-e21转染mda-mb-231-gfp和mda-mb-231-gtx920细胞分别敲除piwil2(e7)mrna和pl2l60(e21)mrna,结果表明敲除piwil2mrna对细胞增殖没有抑制作用，甚至可以促进肿瘤细胞增殖；但是，敲除pl2l60mrna显著抑制细胞增殖。再次证实piwil2表达对肿瘤有抑制作用，而piwil2异化激活可通过诱导肿瘤干细胞促进肿瘤发生发展。

图8显示了pl2l60提高肿瘤细胞的增殖和迁移能力。实时成像系统检测表明：乳腺癌细胞mda-mb-231和mcf-7过表达pl2l60(gtx-920)导致细胞增殖加速(a、b)和侵袭、迁移能力增强(c、d)。

图9显示了pl2l60提高肿瘤细胞的致瘤能力：由图a和图b所示，pl2l60(gtx-920)促进乳腺癌细胞(mda-mb-231和mcf-7)圆球体形成和生长；由图c和图d所示，pl2l60促进肿瘤生成。

(三)癌前干细胞能诱导广谱自然肿瘤免疫(naturallyoccurringtumorimmunity；noti)

pl2l60作为肿瘤特异性广谱标志物，是否具有免疫原性，在肿瘤免疫疗法中意义重大。癌前干细胞表达高水平pl2l60蛋白，它是肿瘤干细胞发展的早期阶段，具有良性和恶性分化的潜能。本部分对癌前干细胞和自然肿瘤免疫之间的关系进行探讨，具体结果如图10～图12所示：

图10显示了癌前干细胞能诱导自然肿瘤免疫(naturallyoccurringtumorimmunity；noti)。图a和图b中，癌前干细胞(2c4、3b5c和3b6c)和淋巴瘤细胞株el-4分别接种c57bl/6小鼠(n＝6)，接种癌前干细胞的小鼠在200天后仍然不长肿瘤，但是接种el-4的小鼠在接种后第七天长肿瘤；

图c和图d中，在210天，预先接种癌前干细胞(3b5c、3b6c)的小鼠再次接种el-4细胞，el-4的致瘤能力在这些小鼠中被抑制。其中50％以上的小鼠不长肿瘤(c)，即使长肿瘤的小鼠，肿瘤也非常小(d)。结果表明癌前干细胞能诱导noti，防止肿瘤进展。

图11显示诱导noti是癌前干细胞特有的功能：(a)用癌前干细胞的活细胞和细胞裂解液(5x106)分别接种b6小鼠8周后,再接种b16f10黑色素瘤细胞(7x105)。结果显示活细胞和细胞裂解液均能有效地诱导noti。(b)用不同浓度的癌前干细胞和淋巴瘤细胞el-4的裂解液免疫b6c小鼠，8周后接种b16f10细胞。结果显示只有癌前干细胞裂解液能诱导noti，el-4细胞无此能力。裂解液的细胞数量与其诱导的noti强度有关。

图12显示了癌前干细胞诱导的noti是非组织特异性的：(a)用癌前干细胞(pcsc,来源淋巴瘤)、el-4和b16f10肿瘤细胞的裂解液接种小鼠8周后接种b16f10肿瘤细胞。结果显示只有癌前干细胞裂解液诱导的noti最强，可在60％以上的小鼠完全抑制黑色素瘤的生长；(b)图a实验的肿瘤大小。结果显示，癌前干细胞裂解液接种后的noti是广谱的，对黑色素瘤和淋巴瘤(图11)的抑制能力是相似的。

(四)pl2l60蛋白是癌前干细胞诱导noti的主要成分

采用dc-pl2l疫苗诱导高效抗肿瘤免疫，抑制肺转移癌。用pl2l多肽pa或pb致敏骨髓树突状细胞(dc)后，皮下接种c57bl/6小鼠，4周后静脉注射b16f10，两周后处死小鼠收集肺组织，石蜡切片，显微镜下计数转移肿瘤或炎症灶(counts/section)。如图13结果显示：pb多肽比pa多肽诱导较强的noti(a)肿瘤发病率；(b)转移瘤和炎症灶；(c)h&e肺组织染色后不同放大倍数的显微照片。上排：炎症灶；下排：转移瘤。

(五)pl2l60靶向单抗kao2和kao3能够杀伤小鼠和人的肿瘤细胞，有效地抑制人和小鼠肿瘤细胞的成瘤能力

图14显示了pl2l60单抗(kao2)有效地抑制肿瘤细胞成瘤和转移。癌前干细胞(2c4g2)用单抗kao2培养上清(100微升)或培养基处理后接种至scid小鼠腹股沟皮下(n＝3/组)。结果表明：kao2单抗处理的细胞没有长成肿瘤(a&b)，但是，培养基处理的均长成肿瘤(b&c)。为了评估kao2单抗对转移瘤的作用，用kao2培养上清处理b16f10黑色素瘤细胞后静脉注射到b6小鼠。两周后小鼠处死，收集肺组织检查转移灶。结果表明kao2处理b16f10的转移能力被显著抑制(d)，注射kao2处理的b16f10细胞的小鼠的肺组织内，显微镜下转移灶明显低于未处理组。

图15显示了kao3单抗处理人和小鼠肿瘤能有效地抑制各种肿瘤生长。小鼠癌前干细胞2c4和癌症干细胞326t-4以及人肿瘤细胞(乳腺癌：mda-mb-231；肺癌：a549；宫颈癌：hela)分别用kao3单抗培养上清或培养基处理后接种免疫缺陷小鼠(scid)观察期肿瘤成瘤率和肿瘤大小。同时，生长肿瘤在直径1.0cm大小用kao3抗体治疗，对照组用培养上清(ctrl)。如图a-图d所示，kao3抗体可以有效地抑制人和小鼠肿瘤生成，在治疗时，也能有效地抑制肿瘤生长(图e和图f)。

图16显示了kao3抗体能诱导肿瘤细胞凋亡。用不同浓度的kao3单抗上清(0,1,2,4,8微升/孔)处理人和小鼠肿瘤细胞24小时后检测其对细胞活力的影响。(a)流式细胞仪检测凋亡细胞例子。(b)kao3处理对肿瘤细胞活力影响的统计结果；(c)不同浓度对细胞凋亡影响的的统计结果和(d)细胞在培养空中的显微照片。结果显示：kao3抗体处理人和小鼠肿瘤细胞后，都不同程度地诱导细胞凋亡。这些凋亡细胞可能是肿瘤干细胞。

图17显示了kao3单抗可以激活人补体杀死人和小鼠肿瘤细胞。(a)肿瘤细胞与kao3和人补体孵育一小时后用流式细胞仪检查凋亡细胞。(b)肿瘤细胞与kao3和人补体孵育3小时后，测定细胞活性，确定凋亡细胞的百分率。结果显示：kao3可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110>上海易范科生物科技有限公司

<120>pl2l60蛋白在制备早期筛查或诊断肿瘤试剂盒中的应用

<160>1

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