一种烟草及烟草制品中异菌脲的高效液相色谱-质谱的测定方法与流程

本发明属于烟草制品中农药残留的理化检验
技术领域：
，主要涉及烟草中异菌脲残留量的测定技术，具体说是用碱性溶液将样品中的异菌脲全部分解成代谢物[异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺）]，酸化后，用二氯甲烷液液萃取，过滤，以液相色谱-质谱测定样品中异菌脲代谢物的含量，从而间接测定样品中异菌脲的含量。
背景技术：
：烟草作为吸食品，其农药残留量问题已成为吸烟安全性问题中的重要组成部分，烟草及烟草制品农药残留量指标是各国在烟草制品质量控制中的重要内容，已成为国际市场烟叶评价和选购的重要因素，也是烟草国际贸易中进行商品检验的重要内容。异菌脲（iprodione），又名扑海因，属于二甲酰亚胺类，是一种广谱性触杀型保护性杀菌剂。该杀菌剂对病原真菌生活史中的各发育阶段均有影响，广泛用于果树、蔬菜、谷物的病害防治和水果的贮藏保鲜。适宜于叶面喷雾防治番茄灰霉病、早疫病和苹果斑点落叶病等蔬菜和水果病害。目前，中国制定异菌脲在烟草、黄瓜和番茄上的mrl（最大残留限量）值分别为0.1、2.0和5.0mg/kg。目前异菌脲残留量的检测多采用gc-ms，hplc、hplc-ms方法，前处理方法主要有液液萃取、固相萃取、基质分散固相萃取。这些方法均是以异菌脲为检测对象，但是在样品中异菌脲容易分解，生成异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺）【中国农学通报，2017,33:150-153,异菌脲在杨梅果实中的残留消解动态研究】，因此仅仅检测样品中异菌脲的含量并不能准确的评估样品中异菌脲的残留。本发明的测定方法正是基于此而提出的。技术实现要素：本发明的目的旨在针对烟草基质情况复杂，样品种类多等现状，克服现有技术缺陷，提供一种液液萃取与基质配标法相结合，直接以液相色谱-质谱测定烟草制品中异菌脲代谢物残留量的测定方法，从而间接测定样品中异菌脲的含量。该方法能快速、准确检测烟草中异菌脲残留总量，测定结果准确、测定干扰少。本发明的机理是在碱性环境中将样品中的异菌脲全部转化为异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺），通过测定异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺）的含量间接测定了样品中异菌脲的总量，方法简便，为烟草中异菌脲残留量测定提供了新的思路。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种烟草及烟草制品中异菌脲的高效液相色谱-质谱的测定方法，用碱性溶液将样品中的异菌脲全部分解成其代谢物即异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺），盐酸酸化后，用二氯甲烷液液萃取，过滤，氮吹近干后用乙腈复溶，以液相色谱-质谱测定样品中异菌脲代谢物的含量，从而间接测定样品中异菌脲的含量。具体包括以下步骤：a、样品的提取：准确称取1.0g样品（精确至0.01g）于50ml具盖离心管中。加入0.2mol/l的氢氧化钠溶液18ml，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min。然后放置于90℃的水浴锅中水浴30min。冷却至室温，加入质量分数为30%的盐酸溶液2.0ml,混匀，再加入10ml二氯甲烷，以2000rpm速率振荡2min。吸取下层清液1ml,氮吹近干后用1.0ml乙腈复溶，经0.45μm有机相滤膜过滤，用lc-ms检测；b、标准工作溶液制备：分别称取10mg（精确至0.1mg）异菌脲代谢物标准品于10ml容量瓶中，根据标准品的溶解度选用乙腈进行溶解并定容至刻度，配制成一级标准储备液。移取1.0ml标准储备液于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到二级标准储备液。标准储备液在避光、-18℃下保存。移取不同体积的二级标准储备液，并用空白样品提取液稀释并最终配制成具有浓度梯度的标准工作溶液；具体是：分别移取二级标准储备液25μl,50μl,100μl,250μl,500μl及1000μl到6个10ml容量瓶中，用空白样品提取液定容。c、液相色谱-质谱测定:吸取以上配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入液相色谱-质谱仪；d、农药残留量测定结果的计算以外标法进行残留量的定量分析，即以异菌脲代谢物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99,对提取后的样品进行测定，测得目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中的异菌脲代谢物的残留量，从而根据公式计算得到样品中异菌脲的含量。采用的液相色谱条件为：色谱柱：atlantist3(150mm×2.1mm，3.0μm)；流动相a：乙腈；流动相b:0.1%甲酸水溶液（体积分数）；等度洗脱，流动相a:流动相b=4:1；流速：0.2ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描;电喷雾离子源(esi);雾化气流量为60psi;气帘气流量20psi;辅助加热气流量为60psi;离子化温度500℃;停留时间为100msec;电离电压5500v,q1扫描模式采集，扫描参数见表1。表1监测离子及去簇电压中文名称定量离子定性离子去簇电压(v)异菌脲代谢物243159.9-80本发明的方法克服了现有技术样品处理方法的不足，针对异菌脲及其代谢物的特点，优化了样品前处理方法和仪器检测条件。与现有技术相比本发明方法具有如下优良效果：（1）由于样品中异菌脲容易分解，生成异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺），因此仅仅检测样品中异菌脲的含量并不能准确的评估样品中异菌脲的残留情况。本发明在碱性环境中将样品中的异菌脲全部转化为异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺），通过测定异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺）的含量间接测定了样品中异菌脲的总量，实验操作简单、快捷，填补了该类物质测定的空白。（2）本发明方法具有操作准确、灵敏度高及重复性好的优点。①本发明方法的检测限：将不同浓度的标准工作溶液注入lc-ms，以3倍信噪比（s/n=3）计算检测限（lod），检测限为0.08mg/kg。②本发明方法的重复性和加标回收率：在空白的烟草样品中加入异菌脲代谢物的标准溶液，然后进行前处理和lc－ms分析，并按照加标量和测定值计算其回收率，结果见表2。由表2可以看出，异菌脲代谢物的平均回收率为90.8%，平均相对标准偏差（rsd）小于5%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。表2回收率和重复性（n=5）附图说明图1为本发明的测定方法流程图（该图作为摘要附图）。图2本发明加标样品的选择离子色谱图。具体实施方式本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。实例1：1．仪器与试剂：农药均为标准品；乙腈、甲酸均为农残级。api4000四极杆串联质谱仪；涡旋振荡仪(美国labnet公司)；sigma3-30k离心机(德国sigma公司)；ae163电子天平（感量：0.0001g）和ae166电子天平（感量：0.01g）（瑞士mettler公司）。2．样品处理：准确称取1.0g样品（精确至0.01g）于50ml具盖离心管中。加入0.2mol/l的氢氧化钠溶液18ml，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min。然后放置于90℃的水浴锅中水浴30min。冷却至室温，加入质量分数为30%的盐酸溶液2.0ml,混匀，再加入10ml二氯甲烷，以2000rpm速率振荡2min。吸取下层清液1ml,氮吹近干后用1.0ml乙腈复溶，经0.45μm有机相滤膜过滤，用lc-ms检测；3.准备标准工作溶液：分别称取10mg（精确至0.1mg）异菌脲代谢物标准品于10ml容量瓶中，根据标准品的溶解度选用乙腈进行溶解并定容至刻度，配制成一级标准储备液。移取1.0ml标准储备液于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到二级标准储备液。标准储备液在避光、-18℃下保存。分别移取二级标准储备液25μl,50μl,100μl,250μl,500μl及1000μl到6个10ml容量瓶中，用乙腈定容。4.测定方法:将配制好的不同浓度的标准工作溶液注入lc-ms，以外标法进行残留量的定量分析，即以异菌脲代谢物的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，相关系数大于等于0.99。对提取后的样品进行测定，测得异菌脲代谢物的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中异菌脲代谢物的残留量。求得样品中的异菌脲代谢物的含量分别为0.32mg/kg，计算得到异菌脲的含量为0.43mg/kg。采用的液相色谱条件为：色谱柱：atlantist3(150mm×2.1mm，3.0μm)；流动相a：0.1%甲酸乙腈溶液（体积分数）；流动相b:0.1%甲酸水溶液（体积分数）；等度洗脱，流动相a:流动相b=4:1；流速：0.2ml/min；柱温：40℃；进样量：10μl；采用的质谱条件：扫描方式：负离子扫描;电喷雾离子源(esi);雾化气流量为60psi;气帘气流量20psi;辅助加热气流量为60psi;离子化温度500℃;停留时间为100msec;电离电压5500v,q1扫描模式采集.为判断方法的准确性，在此样品中加入标准溶液，使得样品中异菌脲代谢物的理论含量为0.50mg/kg,进行同上的样品前处理，以lc-ms测得异菌脲代谢物的定量离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中异菌脲代谢物的含量为0.48mg/kg，添加回收率为88.9%。实例2：如实施例1所述，选择另一烟草样品，样品中未检出异菌脲代谢物[异菌脲脱-（n-异丙基甲酰胺）]。当前第1页12