一种α1-微球蛋白检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种α1-微球蛋白检测试剂盒。
背景技术：
：α1-mg广泛存在于人体各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的α1-mg以两种形式存在，即游离的α1-mg和与iga结合的α1-mg(α1mg-iga)。正常情况下，α1mg-iga约占血液中总α1-mg的40一70％，血液中免疫球蛋白水平对α1-mg及α1mg-iga之间的比例有影响。血液中游离的α1-mg可自由通过肾小球滤过膜，95％-99％在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出；而α1mg-iga则不能通过正常的肾小球，其在正常人尿液中的浓度为零。α1-mg与iga结合面的抗原决定簇(theepitopeofα1-mgandigabingdingsite以下简写eobs)抗体有两个可以识别抗原决定簇的臂(fab)，而且抗原通常情况下有多个抗原决定簇，所以抗原和抗体可以形成巨大的网状结构，甚至可以形成肉眼可见的沉淀，这是免疫沉淀和免疫比浊的基础。使用免疫比浊方法测定抗原浓度时，通常情况下(未出现hook效应前)，在抗体用量不变的情况下，抗原的浓度多少和所形成的浊度多少成非线性正比。一般的，先使用已知浓度的多个标准抗原和一定浓度的抗体制作浊度(通常用吸光度表示)与浓度的关系图，即为定标曲线。然后再测定未知浓度的样本，根据定标曲线，以及样本的浊度，计算出其浓度。然而，本质上，浊度的高低并不是和抗原的浓度相关，而是和一定浓度抗原中的抗原决定簇数量相关。测定血液中的α1-mg时，如果不加特殊处理，α1mg-iga的eobs被遮盖不会暴露，无法和抗体结合。而且α1mg-iga在不同的样本中比例不同，这将造成不同样本中的相同浓度的α1-mg所形成的浊度会因结合型α1-mg含量不同而不同，结合型α1-mg含量越高，浊度被低估越厉害，从而造成无法准确的测定血液中α1-mg的浓度；同样的，在肾病患者尿液中，结合型α1-mg会因为肾损伤漏到尿液中，而且漏出比例暂无法确定，肾小球肾病患者的尿液中α1-mg也会因结合型α1-mg问题无法准确测定。通过以上分析，可以意识到以下方式可以改进免疫比浊方法α1-mg试剂盒的测定准确性：使用两株及两株以上不识别eobs的单克隆抗体；使用多克隆抗体时，增加纯化步骤，去掉识别eobs的抗体；或测定过程中，进行前处理，分离结合型α1-mg中α1-mg和iga，暴露eobs；但是免疫比浊试剂中，单克隆抗体因为成本、效价以及haaa(异嗜性抗体)问题，仅在多克隆抗体无法避免交叉反应的项目中才会被使用，如d-dimer和igg4；而增加纯化步骤，提高了抗体生产成本；即简单可行的前处理方式，将是较理想的改进α1-mg测定准确性的方式。通过对现有技术的了解，专利“cn201410193619”和“cn201510847828”均无内容提到此申请文件所述问题，以及解决方案。因为α1-mg的测定比较困难，如果不进行前处理操作或者其他特殊方法，α1-mg测定将会不同程度低估，目前国内α1-mg试剂普遍情况即为临床样本测定结果比西门子系统不同程度偏低，临床样本相关性较差。目前市面上作为金标准的α1-mg测定试剂是西门子特定蛋白分析系统bnii上的α1-mg试剂；而西门子α1-mg试剂，是在其特定蛋白分析系统bnii上使用的，分析速度低于250test/小时，且价格昂贵；无法满足大型医院以及体检中心海量样本测试，以及国家降低检查费用的需求。多数检验中心均采用购买多台西门子bnii系统的方式提高通量，进一步提高设备成本。因此，提供一种成本较低，符合国家降低检查费用需求，且在不影响灵敏度的情况下，准确测定尿液和血清样本中α1-微球蛋白的国产检测试剂盒，是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，在不影响灵敏度的情况下，准确测定尿液和血清样本中α1-微球蛋白；此外，本发明提供的试剂盒成本较低，符合国家降低检查费用需求。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种α1-微球蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r2为标记有α1-mg抗体的胶乳微球溶液；所述试剂r1包括50-100mm/l的柠檬酸-naoh缓冲液；tcep20-50g/l和氯化钠600-1400mm/l；所述试剂r2包括，10mm的磷酸盐缓冲液；80-120nm胶乳微球3.6g/l；α1-mg抗体20ml/l。优选的，所述试剂r1中所述氯化钠浓度为700mm/l；优选的，所述试剂r2中所述tcep浓度为25g/l；本发明中，iga和α1-mg是非共价结合的，高盐可能利于非共价分开，利于分散抗原，有利于临床测定，但是高盐会大幅度降低灵敏度，但是一定范围内酸性r1，有利于提升试剂灵敏度，抵消高盐的坏处，保证试剂灵敏度不受太大影响。本发明公开的试剂r1和试剂r2具有使α1-mg和iga分离的目的。本发明公开的试剂盒，可在自动生化分析仪上使用，速度从400-2000test/小时不等，并且兼容自动流水线，通量极大，不需要医院新增设备；同时本发明为国产试剂，成本较低，符合国家降低检查费用的需求。进一步的，所述试剂r1还包括0.5ml/l的防腐剂、5ml/l的分散剂和2-10g/l的增敏剂。进一步的，所述试剂r2还包括0.5ml/l的防腐剂和5ml/l的分散剂。进一步的，所述防腐剂为pc-300；所述分散剂为吐温-20；所述增敏剂为聚乙二醇peg4000、聚乙二醇peg6000、聚乙二醇peg8000、聚乙二醇peg12000或聚乙二醇peg20000中的一种或几种。进一步的，所述试剂r1的ph值为5.5-6.3。优选的，所述试剂r1的ph值为5.9；本发明限定试剂r1的ph值，使其抵消高盐的带来的灵敏度降低的影响，从而进一步保证试剂灵敏度。进一步的，所述试剂r2的ph值为6.9-7.8。进一步的，试剂r1与所述试剂r2混合后的最终反应液ph值小于6.5；所述最终反应液的盐离子强度为了450-1050mm/l。最终反应液ph值小于6.5，使得最终反应液为弱酸性环境，对灵敏度进行提升，同时抵消高盐对试剂灵敏度的影响，充分发挥高盐对iga和α1-mg之间非共价的拆分，分散抗原。但是ph过低时，会有非特异反应。进一步的，所述试剂盒能够检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，具有如下技术优点：本发明公开的试剂盒，可在自动生化分析仪上使用，速度从400-2000test/小时不等，并且兼容自动流水线，通量极大，不需要医院新增设备；同时本发明中的试剂盒在不影响灵敏度的情况下，能够准确测定尿液和血清样本中α1-微球蛋白，且成本较低，符合国家降低检查费用的需求。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本发明提供的对比例1中的试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂的测定结果相关性；图2附图为本发明提供的实施例1中的试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂的测定结果相关性；图3附图为本发明提供的实施例2中的试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂的测定结果相关性；图4附图为本发明提供的实施例3中的试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂的测定结果相关性；图5附图为本发明提供的实施例4中的试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂的测定结果相关性。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。对比例1本对比例提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，试剂盒包括试剂r1和试剂r2，试剂r2为标记有α1-mg抗体的胶乳微球溶液；试剂r1：50mm/l浓度的磷酸盐缓冲液，ph7.00；氯化钠150mm/l；吐温-205ml/l；聚乙二醇60002g/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；试剂r2：10mmph7.2的磷酸盐缓冲液；吐温-202ml/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；100nm胶乳微球3.6g/l；dako货号q0495的α1-mg抗体20ml/l；本对比例公开的试剂盒为常见的α1-mg试剂参数，2ul样本，200ul试剂r1，67ul试剂r2，570nm单波长，在日立7180全自动生化分析仪上测试，δabs(吸光度变化值)使用两点终点法计算，18-34测光点读取，可以计算得知，最终试剂r1与试剂r2混合后的最终反应液缓冲液中nacl浓度为113mm/l，ph值在6.9-7.00左右，不在本发明限定范围内。首先，使用dako货号x0977多项目尿液质控物高值，含α1-mg68mg/l进行多点定标，绘制标准曲线，如表1：表1试剂盒的定标数据由表1可以看到，17mg/l浓度的分析灵敏度达到1633；同时测定尿液参考值12mg/l附近的10mg/l左右样本10次，计算精密度cv，数据如表2；表2尿液参考值12mg/l附近的精密度精密度10mg/l10.110.49.910.210.110.310.210.210.39.9mean10.16stdev0.156205cv1.54％由表2可知，本对比例的精密度cv仅1.54％，远远低于特定蛋白分析试剂精密度通常5％以内的要求。然后，使用10例血液样本，10例尿液样本，与西门子bniiα1-mg试剂进行比对，以西门子为标准计算偏差，数据如表3：表3对比例1中的试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂对样本中的α1-mg的检测由表3可知，本对比例中的试剂盒不论血液还是尿液样本，均不同程度的和西门子测定结果相比偏低，偏差最高达到52.26％；体外诊断试剂测定准确度，通常要求偏差在15％甚至10％以内，显然和金标准相比，对照实验组不符合测定准确的要求。最后，使用西门子数据为x轴，对照组实验数据为y轴，excel绘制相关性图，添加趋势线，显示相关性r平方，如图1。由图1可知，本对比例中的试剂盒与西门子试剂测定结果相关性较差，相关系数r平方为0.9274。实施例1本实施例提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，试剂盒包括试剂r1和试剂r2，试剂r2为标记有α1-mg抗体的胶乳微球溶液；试剂r1：50mm/l浓度的柠檬酸-naoh缓冲液，ph5.5；tcep20g/l；氯化钠600mm/l；吐温-205ml/l；聚乙二醇60002g/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；试剂r2：10mmph7.8的磷酸盐缓冲液；吐温-202ml/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；100nm胶乳微球3.6g/l；dako货号q0495的α1-mg抗体20ml/l；使用常见的α1-mg试剂参数，2ul样本，200ul试剂r1，67ul试剂r2，570nm单波长，在日立7180全自动生化分析仪上测试，δabs(吸光度变化值)使用两点终点法计算，18-34测光点读取，可以计算得知，最终试剂r1与试剂r2混合后的最终反应液缓冲液中nacl浓度为450mm/l，实测ph值在6.5以内。首先，使用dako货号x0977多项目尿液质控物高值，含α1-mg68mg/l进行多点定标，绘制标准曲线，如表4：表4试剂盒的定标数据由表4可知，17mg/l浓度的分析灵敏度达到1518；同时测定尿液参考值12mg/l附近的10mg/l左右样本10次，计算精密度cv，数据表5：表5尿液参考值12mg/l附近的精密度精密度10mg/l10.210.210.210.19.810.310.210.110.410.5mean10.2stdev0.178885cv1.75％由表5可知，实施例1，精密度极好，cv仅1.75％，远远低于特定蛋白分析试剂精密度通常5％以内的要求。最后，使用10例血液样本，10例尿液样本，与西门子bniiα1-mg试剂进行比对，以西门子为标准计算偏差，数据如表6：表6试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂对样本中的α1-mg的检测由表6可知，实施例1公开的试剂盒，不论血液还是尿液样本，均不同程度的和西门子测定结果相比偏低，但是相比对照组，偏差大幅度改善，最高偏差缩小到14.38％；体外诊断试剂测定准确度，通常要求偏差在15％甚至10％以内，显然和金标准相比，实施例1符合测定准确的要求，但处于偏差不合格边缘。最后，使用西门子数据为x轴，实施例1实验数据为y轴，excel绘制相关性图，添加趋势线，显示相关性r平方，如图2。由图2可知，实施例1中公开的试剂盒组与西门子试剂测定结果相关性很好，相关系数r平方为0.9981。实施例2本实施例提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，试剂盒包括试剂r1和试剂r2，试剂r2为标记有α1-mg抗体的胶乳微球溶液；试剂r1：50mm/l浓度的柠檬酸-naoh缓冲液，ph6.3；tcep20g/l；氯化钠1400mm/l；吐温-205ml/l；聚乙二醇60002g/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；试剂r2：10mmph6.9的磷酸盐缓冲液；吐温-202ml/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；100nm胶乳微球3.6g/l；dako货号q0495的α1-mg抗体20ml/l；使用常见的α1-mg试剂参数，2ul样本，200ul试剂r1，67ul试剂r2，570nm单波长，在日立7180全自动生化分析仪上测试，δabs(吸光度变化值)使用两点终点法计算，18-34测光点读取，可以计算得知，最终试剂r1与试剂r2混合后的最终反应液缓冲液中nacl浓度为1050mm/l，实测ph值在6.5以内。首先，使用dako货号x0977多项目尿液质控物高值，含α1-mg68mg/l进行多点定标，绘制标准曲线，如表7：表7试剂盒的定标数据由表7可知，17mg/l浓度的分析灵敏度达到593；同时测定尿液参考值12mg/l附近的10mg/l左右样本10次，计算精密度cv，数据如表8：表8尿液参考值12mg/l附近的精密度精密度10mg/l10.310.410.59.810.49.79.710.610.210.5mean10.21stdev0.33cv3.23％由表8可知，实施例2，精密度较好，cv3.23％，低于特定蛋白分析试剂精密度通常5％以内的要求。但是相比实施例1和对照组，较差。最后，使用10例血液样本，10例尿液样本，与西门子bniiα1-mg试剂进行比对，以西门子为标准计算偏差，数据如表9：表9试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂对样本中的α1-mg的检测由表9可知，实施例2公开的试剂盒，不论血液还是尿液样本，均不同程度的和西门子测定结果相比偏低，但是相比对照组，偏差大幅度改善，相比实施例1也有改善，最高偏差缩小到11.90％；体外诊断试剂测定准确度，通常要求偏差在15％甚至10％以内，显然和金标准相比，实施例2符合测定准确的要求。最后，使用西门子数据为x轴，实施例2实验数据为y轴，excel绘制相关性图，添加趋势线，显示相关性r平方，如图3。由图3可知，实施例2公开的试剂盒与西门子试剂测定结果相关性很好，相关系数r平方为0.9982。实施例3本实施例提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，试剂盒包括试剂r1和试剂r2，试剂r2为标记有α1-mg抗体的胶乳微球溶液；试剂r1：100mm/l浓度的柠檬酸-naoh缓冲液，ph6.3；tcep50g/l；氯化钠1400mm/l；吐温-205ml/l；聚乙二醇60002g/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；试剂r2：10mmph6.9的磷酸盐缓冲液；吐温-202ml/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；100nm胶乳微球3.6g/l；dako货号q0495的α1-mg抗体20ml/l；使用常见的α1-mg试剂参数，2ul样本，200ul试剂r1，67ul试剂r2，570nm单波长，在日立7180全自动生化分析仪上测试，δabs(吸光度变化值)使用两点终点法计算，18-34测光点读取，可以计算得知，最终最终试剂r1与试剂r2混合后的最终反应液缓冲液中nacl浓度为1050mm/l，实测ph值在6.5以内首先，使用dako货号x0977多项目尿液质控物高值，含α1-mg68mg/l进行多点定标，绘制标准曲线，如表10：表10试剂盒的定标数据由表10可知，17mg/l浓度的分析灵敏度达到395，是所有实施例中最低的；同时测定尿液参考值12mg/l附近的10mg/l左右样本10次，计算精密度cv，数据如表11：表11尿液参考值12mg/l附近的精密度精密度10mg/l10.59.610.210.410.511.19.310.610.310.2mean10.27stdev0.481768cv4.69％由表11可知，可以看到，实施例3，精密度较差，cv4.69％，虽然低于特定蛋白分析试剂精密度通常5％以内的要求。但是相比实施例1，2和实施例1，效果较差，处于不合格边缘。最后，使用10例血液样本，10例尿液样本，与西门子bniiα1-mg试剂进行比对，以西门子为标准计算偏差，数据如表12：表12试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂对样本中的α1-mg的检测由表12可知，实施例3公开的试剂盒，不论血液还是尿液样本，均不同程度的和西门子测定结果相比偏低，但是相比对比例1，偏差大幅度改善，相比实施例1，2也有改善，最高偏差缩小到9.38％；体外诊断试剂测定准确度，通常要求偏差在15％甚至10％以内，显然和金标准相比，实施例3符合测定准确的要求，是所有实施例中偏差最小的。最后，使用西门子数据为x轴，实施例3实验数据为y轴，excel绘制相关性图，添加趋势线，显示相关性r平方，如下图，如图4。由图4可知，实施例3公开的试剂盒与与西门子试剂测定结果相关性很好，相关系数r平方为0.9991。从实施例1-3我们可以看到，本发明能够有效改善α1-mg检测试剂测定的准确性，但是仅在一定范围内有效。具体地高盐浓度，极大的影响α1-mg检测试剂的灵敏度，同时，tcep浓度高，更进一步抑制α1-mg检测试剂灵敏度。此外在一定范围内的酸性环境(过酸则会影响试剂特异性)，利于试剂检测灵敏度，本发明中强缓冲力的酸性r1，用于平衡高盐离子以及tcep对试剂灵敏度的杀伤作用，本发明需要同时平衡ph，盐离子，tcep影响检测的精密度是准确性的前提，精密度太差，不利于准确性，所以虽然实施例3准确度最佳，临床结果与西门子相关性最好，但精密度已经处于不合格边缘。实施例4本实施例提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，试剂盒包括试剂r1和试剂r2，试剂r2为标记有α1-mg抗体的胶乳微球溶液；试剂r1：100mm/l浓度的柠檬酸-naoh缓冲液，ph5.9；tcep25g/l；氯化钠700mm/l；吐温-205ml/l；聚乙二醇60002g/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；试剂r2：10mmph6.9的磷酸盐缓冲液；吐温-202ml/l；防腐剂pc-3000.5ml/l；100nm胶乳微球3.6g/l；dako货号q0495的α1-mg抗体20ml/l；使用常见的α1-mg试剂参数，2ul样本，200ul试剂r1，67ul试剂r2，570nm单波长，在日立7180全自动生化分析仪上测试，δabs(吸光度变化值)使用两点终点法计算，18-34测光点读取可以计算得知，最终最终试剂r1与试剂r2混合后的最终反应液缓冲液中nacl浓度为525mm/l，实测ph值在6.5以内。首先，使用dako货号x0977多项目尿液质控物高值，含α1-mg68mg/l进行多点定标，绘制标准曲线，如表13：表13试剂盒的定标数据由表13可知，17mg/l浓度的分析灵敏度达到1233；同时测定尿液参考值12mg/l附近的10mg/l左右样本10次，计算精密度cv，数据如表14：表14尿液参考值12mg/l附近的精密度由表14可知，实施例4，精密度极好，cv1.74％，远远低于特定蛋白分析试剂精密度通常5％以内的要求。最后，使用10例血液样本，10例尿液样本，与西门子bniiα1-mg试剂进行比对，以西门子为标准计算偏差，数据如表15：表15试剂盒与西门子bniiα1-mg试剂对样本中的α1-mg的检测西门子bnii实施例4偏差血样本1130.00113.9-12.38％血样本299.7094.7-5.02％血样本336.3032.5-10.47％血样本472.2065.1-9.83％血样本568.5062.2-9.20％血样本6153.47138.1-10.01％血样本728.3228.2-0.42％血样本8107.5294.4-12.20％血样本932.4029.3-9.57％血样本1026.1025.2-3.45％尿样本1118.7018.1-3.21％尿样本129.439.3-1.38％尿样本1314.3014.1-1.40％尿样本14112.60100.5-10.75％尿样本156.766.5-3.85％尿样本165.465.50.73％尿样本1772.3068.1-5.81％尿样本1815.2015.1-0.66％尿样本1940.0038.2-4.50％尿样本206.336.3-0.47％由表15可知，实施例4公开的试剂盒，不论血液还是尿液样本，均不同程度的和西门子测定结果相比偏低，但是相比对照组，偏差大幅度改善，相比实施例1也有改善，最高偏差缩小到12.38％；体外诊断试剂测定准确度，通常要求偏差在15％甚至10％以内，显然和金标准相比，实施例4符合测定准确的要求。最后，使用西门子数据为x轴，较优实验数据为y轴，excel绘制相关性图，添加趋势线，显示相关性r平方，如图5。由图5可知，实施例4公开的试剂盒与与西门子试剂测定结果相关性很好，相关系数r平方为0.9983。本发明公开了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，本发明公开的试剂盒，可在自动生化分析仪上使用，速度从400-2000test/小时不等，并且兼容自动流水线，通量极大，不需要医院新增设备；同时本发明中的试剂盒在不影响灵敏度的情况下，能够准确测定尿液和血清样本中α1-微球蛋白，且成本较低，符合国家降低检查费用的需求。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12