检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞炎症因子分泌量影响方法与流程

本发明属于烟草制品的安全性生物学效应评价技术领域，特别涉及检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞炎症因子分泌量影响方法。

背景技术：

随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。加热不燃烧卷烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。

加热非燃烧型卷烟，其特征在于加热烟草而非燃烧烟草，向消费者提供一定的烟草特征感受。加热不燃烧卷烟制品研发人员在产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整后形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。

检测对象的改变导致样品的前处理方法、检测用细胞、检测剂量等出现很大差异，这些差异会对试验结果的准确性产生较大影响，现有的用于检测卷烟烟气对细胞炎症因子分泌量影响的方法已经不能满足加热不燃烧卷烟制品对细胞炎症因子分泌量影响的检测需要。目前，国内外研究机构及烟草公司尚未有针对加热不燃烧卷烟制品对细胞炎症因子分泌量影响的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其以加热不燃烧卷烟总粒相物作为检测基础，为准确评价加热不燃烧卷烟制品对安全性评估提供有效测定方法。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

本发明中所使用的rpmi1640细胞培养基购买于市场任何可购买到的商品公司。

检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞炎症因子分泌量影响方法，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mtpm；

mtpm＝m1-m0(1)

式中：

m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50ml的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/ml；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml的冻存管中，-80℃保存待用；

(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞rpmi2650复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中，加入10mlrpmi1640细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的rpmi1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用rpmi1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用rpmi1640细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/ml，再按接种量为1ml/孔接种到12孔细胞培养板中，然后将12孔细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用pbs稀释成400μg/ml的工作液备用，取出12孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；

表1细胞炎症因子分泌量检测加样表

(6)受试物孵育品的收集：培养完成后，分别收集12孔细胞培养板每孔中的上清液，1000rpm离心20min，然后用1.5ml离心管分别收集各孔的离心后上清液备用；

(7)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；

(8)加样：取96孔酶标板，在空白对照孔中加pbs磷酸盐缓冲液100μl，其余孔分别加标准曲线溶液和备用的离心后上清液各100μl，酶标板覆膜，37℃，孵育90分钟；

(9)加入抗体：加样孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，每孔加入抗体工作液100μl，盖酶标板覆膜，37℃，孵育60分钟；

(10)洗板、加酶：加抗体孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350μl/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板3次；然后在每孔中加酶结合工作液100μl，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；

(11)洗板、显色：加酶孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350μl/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板5次；然后在每孔中加底物工作液90μl，盖酶标板覆膜，37℃孵育，30min后加入终止液50μl/孔；

(12)测量吸光值：在酶标仪450nm下检测吸光度；

(13)细胞炎症因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算样品的细胞炎症因子分泌量。

本发明有益效果：

本发明综合考察了加热不燃烧卷烟制品的暴露途径，作用方式，建立了加热不燃烧卷烟总粒相物前处理方法，且根据加热不燃烧卷烟制品作用靶细胞选取人鼻腔上皮细胞rpmi2650作为炎症效应因子分泌量影响检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合加热不燃烧卷烟总粒相物的细胞炎症效应因子分泌量影响检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效地检测加热不燃烧卷烟总粒相物对受试细胞炎症效应的影响。

附图说明

图1为3种加热不燃烧卷烟总粒相物对rpmi2650细胞il-6细胞因子分泌的影响；

图2为3种加热不燃烧卷烟总粒相物对rpmi2650细胞il-8细胞因子分泌的影响；

图3为3种加热不燃烧卷烟总粒相物对rpmi2650细胞il-10细胞因子分泌的影响。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

实施例1

制备3种(1#、2#、3#)加热不燃烧卷烟用剑桥滤片捕集的总粒相物作为样品，以肯塔基参比卷烟3r4f为对照样品，测试其对细胞炎症因子分泌量的影响。

具体检测过程，包括以下步骤：

(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mtpm；

mtpm＝m1-m0(1)

式中：

m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；

捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50ml的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/ml；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml的冻存管中，-80℃保存待用；

(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞rpmi2650复苏后，接种到25cm²细胞培养瓶中，加入10mlrpmi1640细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至85％的汇合率时，移除培养瓶中的rpmi1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育2min，用rpmi1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用rpmi1640细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/ml，再按接种量为1ml/孔接种到12孔细胞培养板中，然后将12孔细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱内培养24h；

(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用pbs稀释成400μg/ml的工作液备用，取出12孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；

表1细胞炎症因子分泌量检测加样表

(6)受试物孵育品的收集：培养完成后，分别收集12孔细胞培养板每孔中的上清液，1000rpm离心20min，然后用1.5ml离心管分别收集各孔的离心后上清液备用；

(7)标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症效应因子的标准曲线溶液；

(8)加样：取96孔酶标板，在空白对照孔中加pbs磷酸盐缓冲液100μl，其余孔分别加标准曲线溶液和备用的离心后上清液各100μl，酶标板覆膜，37℃，孵育90分钟；

(9)加入抗体：加样孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，每孔加入抗体工作液100μl，盖酶标板覆膜，37℃，孵育60分钟；

(10)洗板、加酶：加抗体孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350μl/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板3次；然后在每孔中加酶结合工作液100μl，盖酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；

(11)洗板、显色：加酶孵育完成后，取出96孔酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350μl/每孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板5次；然后在每孔中加底物工作液90μl，盖酶标板覆膜，37℃孵育，30min后加入终止液50μl/孔；

(12)测量吸光值：在酶标仪450nm下检测吸光度；

(13)细胞炎症因子分泌量测定：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算样品的细胞炎症因子分泌量。

由图1、图2可以看出，受试的三个加热不燃烧卷烟样品与参比卷烟3r4f相比，引起细胞分泌的il-6和il-8有显著差异(p<0.05)，在相同检测剂量下，参比卷烟3r4f引起细胞分泌的il-6和il-8高于加热不燃烧卷烟。

由试验结果可以看出，在本发明给出的样品前处理方法、检测剂量条件下，1#、2#、3#号加热不燃烧卷烟总粒相物样品在检测剂量范围内对rpmi2650细胞il-6、il-8炎症效应因子的分泌量存在影响，且有剂量效应关系，与0剂量组相比存在显著差异(p<0.05)；而对rpmi2650细胞il-10炎症效应因子的分泌量无影响，且与0剂量组相比无显著差异(p>0.05)；以上结果表明，加热不燃烧卷烟总粒相物对rpmi2650细胞不同的炎症效应因子的分泌量的影响存在差异。

本发明综合考察了加热不燃烧卷烟制品的暴露途径，作用方式，建立了加热不燃烧卷烟制品前处理方法，且根据加热不燃烧卷烟制品作用靶细胞选取了人鼻腔上皮细胞rpmi2650作为炎症效应因子分泌量影响检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合加热不燃烧卷烟总粒相物的细胞炎症效应因子分泌量影响检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测加热不燃烧卷烟总粒相物对受试细胞炎症效应的影响。