一种细胞穿孔的光学测量系统和方法与流程

本发明涉及细胞光穿孔及生物组织电位测量技术领域，尤其涉及一种细胞穿孔的光学测量系统和方法。

背景技术：

在治疗药物难以治愈的疾病(例如癌症、艾滋病、遗传类疾病等)方面，基因治疗是一种具有前景和有效的手段。基因治疗就是将外源的药物或者基因载入到细胞内，从根本上实现对疾病的治疗。这个过程中，对细胞进行可恢复穿孔是实现基因治疗的关键步骤。

传统的细胞穿孔的方法有生物方法、化学方法、机械方法和物理方法。然而，生物方法具有潜在的毒性，容易感染靶向细胞周围的健康细胞；化学方法的转染效率比较低；机械方法对操作医生的操作熟练度要求特别高。近年来，学者们将研究目光聚焦在了物理方法上。物理方法是借助物理力在细胞膜上面形成微小的穿孔，然后将外源基因和药物载入，主要的物理方法有电穿孔、声穿孔、磁穿孔和光穿孔。其中，电穿孔容易伤害组织；声穿孔精确度比较低，可重复性比较差；磁穿孔效率比较低，转染试剂容易聚集。而光穿孔在克服上面缺点的同时具有非侵入、非接触的优点，而且还可以实现对变异细胞的直接杀死。现有的光穿孔方法主要采用飞秒激光进行激发细胞产生穿孔，而飞秒激光器的造价非常昂贵，是限制光穿孔在基因转染领域应用的主要缺点。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种细胞穿孔的光学测量系统和方法，结合光标测技术记录细胞穿孔过程跨膜电位的变化趋势，通过探测散射光信号可以得到细胞穿孔的尺寸信息，具有非侵入、非接触、成本低的特点。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种细胞穿孔的光学测量系统，包括三维运动平台4，三维运动平台4上设置有细胞培养皿3，三维运动平台4中心设置有直径40mm的圆形孔洞，反射镜2安装在垂直于三维运动平台4的圆形孔洞的正上方，反射镜2与垂直于细胞培养皿3竖直方向的夹角为45°；在反射镜2的水平向右方向上安装有642nm激光器1；三维运动平台4的圆形孔洞的正下方依次垂直设置有物镜5、a二向色镜6、b二向色镜12、c二向色镜13和光电探测装置16；在a二向色镜6的水平向右方向上安装a聚焦透镜7和b聚焦透镜8，在b聚焦透镜8的水平向右方向上安装440nma激光器9；在b二向色镜12的水平向右方向上安装532nmb激光器11；a激光器9和b激光器11分别与延时装置10相连；在c二向色镜13的水平向右方向上安装高速相机14,高速相机14和光电探测装置16分别与dsp处理系统15相连。

所述的物镜5距离三维运动平台4的距离为10.6mm。

所述的a聚焦透镜7和b聚焦透镜8的距离为两个透镜焦距之和。

所述的b激光器11和b二向色镜12组成细胞激发装置，细胞激发装置用于激发细胞并产生穿孔；b激光器11是输出波长为532nm的脉冲激光器；b激光器11输出一束激光，经由b二向色镜12反射，再通过a二向色镜6透射，经由物镜聚焦到细胞表面；b二向色镜12和a二向色镜6都为长波通二向色镜，截止波长分别为505nm和550nm。

a激光器9，b聚焦透镜8，a聚焦透镜7和a二向色镜6组成电压敏感染料激发装置，电压敏感染料激发装置用于激发电压敏感染料产生荧光；a激光器9是输出波长为440nm的脉冲激光器，a激光器9输出一束激光，经由b聚焦透镜8和a聚焦透镜7扩束后，经过a二向色镜6反射，经由物镜5聚焦到细胞表面；电压敏感染料的发射波长为610nm。

激光器1和反射镜2组成散射光激发装置，散射光激发装置用于连续照射细胞使其产生散射光，从而获取细胞穿孔后的穿孔尺寸信息；激光器1是输出波长为642nm的连续激光器；激光器1输出一束连续激光器，经反射镜2反射后照射到细胞表面。

时序控制装置10由1片fpga构成处理系统，用于控制细胞激发装置和电压敏感染料激发装置的工作时序和工作顺序。

光电探测装置16由1个光电二极管组成；散射光激发装置照射细胞后产生的散射光，探测散射光信号；通过物镜5、长波通a二向色镜6、b二向色镜12和c二向色镜13后被光电探测装置16获取；长波通c二向色镜13的截止波长为625nm。

高速相机14和c二向色镜13组成图像获取装置，用于获取细胞膜跨膜电位变化的荧光图像；细胞穿孔后，电压敏感染料激发装置激发电压敏感染料产生的610nm荧光经过物镜5、a二向色镜6和b二向色镜12后被c二向色镜13反射，进入高速相机，得到穿孔后细胞的荧光图像；高速相机采用的是andor_ixon3_897单光子emccd。

dsp处理系统15由1片dsp组成处理系统，用于对获取的细胞穿孔后的荧光图像进行实时处理，得到细胞跨膜电位，以及对光电探测装置获取的散射光信号进行处理得到细胞光穿孔的尺寸信息。

基于上述一种细胞穿孔的光学测量系统的测量方法，包括以下步骤：

s1、将在细胞培养皿3里培育好1×10⁵个细胞，并加入1.8微升浓度为5.6×10⁹个/ml的纳米金，孵育三小时；

s2、在细胞培养皿3里加入2ml浓度为10μl/ml的电压敏感染料；

s3、激光器1用642nm的激光连续照射细胞3s；

s4、b激光器11用532nm的脉冲激光击打细胞，5ns后，a激光器9用440nm的脉冲激光激发电压敏感染料10ms；

s5、在激发电压敏感染料之后，高速相机14和c二向色镜13组成的图像获取装置采集图像；每次采集图像前先进行步骤s4，每次采集图像的时间延时为激发电压敏感染料后5tns，t为自然数，随着采集次数的递增，t每次递增1次；

s6、获取细胞荧光图像之后，通过dsp处理系统15计算和绘制细胞跨膜电位的变化趋势。

所述的s6的具体计算步骤包括：

(1)、在获取的细胞荧光图像中，选取细胞边缘的像素作为荧光信号，选取原则是选取细胞边缘的三个像素的灰度值，沿着细胞边缘选取一周，并将选取的像素点进行平均得到荧光信号的平均值；

(2)、在距离细胞大于两个细胞直径的位置选取十个像素作为噪声信号，并将选取的像素点进行平均得到噪声信号的平均值；

(3)、用荧光信号的平均值减去噪声信号的平均值得到一幅图像膜电位对应的荧光信号值；

(4)、根据荧光信号强度和电位的对应关系计算每幅图像的跨膜电位值。

本发明克服了现有光穿孔方法的缺点，可以低成本的实现对细胞的可恢复穿孔。除此之外，通过探测散射光信号可以得到细胞穿孔的尺寸信息。该方法实现了细胞光穿孔信息的获取，为基因治疗提供了实验信息。具体具有如下优点：

(1)可获得细胞跨膜电位的电压值，以及细胞穿孔、恢复过程的跨膜电压的变化趋势；

(2)可获得细胞穿孔的尺寸信息；

(3)具有高的空间分辨率和时间分辨率；

(4)对操作人员的操作熟练度要求比较低。

附图说明

图1为本发明实施例细胞穿孔的光学测量系统结构框图。

图2为本发明实施例细胞穿孔的光学测量方法流程图。

图3为本发明实施例细胞跨膜电位计算方法流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，一种细胞穿孔的光学测量系统，包括三维运动平台4，三维运动平台4上设置有细胞培养皿3，三维运动平台4中心设置有直径40mm的圆形孔洞，反射镜2安装在垂直于三维运动平台4的圆形孔洞的正上方，反射镜2与垂直于细胞培养皿3竖直方向的夹角为45°；在反射镜2的水平向右方向上安装有642nm激光器1；三维运动平台4的圆形孔洞的正下方依次垂直设置有物镜5、a二向色镜6、b二向色镜12、c二向色镜13和光电探测装置16；在a二向色镜6的水平向右方向上安装a聚焦透镜7和b聚焦透镜8，在b聚焦透镜8的水平向右方向上安装440nma激光器9；在b二向色镜12的水平向右方向上安装532nmb激光器11；a激光器9和b激光器11分别与延时装置10相连；在c二向色镜13的水平向右方向上安装高速相机14,高速相机14和光电探测装置16分别与dsp处理系统15相连。

所述的物镜5距离三维运动平台4的距离为10.6mm。三维运动平台4为100mm*100mm*10mm的平板，平板中间有直径为40mm的圆形孔洞，细胞培养皿3被固定于样品台上。激发细胞的激光和激发电压敏感染料的激光从样品台下方小孔照射样品。

所述的a聚焦透镜7和b聚焦透镜8的距离为两个透镜焦距之和。

所述的b激光器11和b二向色镜12组成细胞激发装置，细胞激发装置用于激发细胞并产生穿孔；b激光器11是输出波长为532nm的脉冲激光器；b激光器11输出一束激光，经由b二向色镜12反射，再通过a二向色镜6透射，经由物镜聚焦到细胞表面；b二向色镜12和a二向色镜6都为长波通二向色镜，截止波长分别为505nm和550nm。

a激光器9，b聚焦透镜8，a聚焦透镜7和a二向色镜6组成电压敏感染料激发装置，电压敏感染料激发装置用于激发电压敏感染料产生荧光；a激光器9是输出波长为440nm的脉冲激光器。a激光器9输出一束激光，经由b聚焦透镜8和a聚焦透镜7扩束后，经过a二向色镜6反射，经由物镜聚焦到细胞表面。电压敏感染料的发射波长为610nm。

激光器1和反射镜2组成散射光激发装置，散射光激发装置用于连续照射细胞使其产生散射光，从而获取细胞穿孔后的穿孔尺寸信息；激光器1是输出波长为642nm的连续激光器；激光器1输出一束连续激光器，经反射镜2反射后照射到细胞表面。

时序控制装置10由1片fpga构成处理系统，用于控制细胞激发装置和电压敏感染料激发装置的工作时序和工作顺序。

光电探测装置16由1个光电二极管组成；散射光激发装置照射细胞后产生的散射光，探测散射光信号；通过物镜5、长波通a二向色镜6、b二向色镜12和c二向色镜13后被光电探测装置16获取。长波通c二向色镜13的截止波长为625nm。

高速相机14和c二向色镜13组成图像获取装置，用于获取细胞膜跨膜电位变化的荧光图像；细胞穿孔后，电压敏感染料激发装置激发电压敏感染料产生的610nm荧光经过物镜5、a二向色镜6和b二向色镜12后被c二向色镜13反射，进入高速相机，得到穿孔后细胞的荧光图像。高速相机采用的是andor_ixon3_897单光子emccd。

dsp处理系统15由1片dsp组成处理系统，用于对获取的细胞穿孔后的荧光图像进行实时处理，得到细胞跨膜电位，，自动实时绘制细胞膜跨膜电位的变化趋势，以及对光电探测装置获取的散射光信号进行处理得到细胞光穿孔的尺寸信息。

如图2所示，本发明实施例提供了一种细胞穿孔的光学标测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

s1、在细胞培养皿3里培育好1×10⁵个细胞，并加入1.8微升浓度为5.6×10⁹个/ml的纳米金，并孵育三小时；

s2、在细胞培养皿3里加入2ml浓度为10μl/ml的电压敏感染料；

s3、激光器1用642nm的激光连续照射细胞3s；

s4、b激光器11用532nm的脉冲激光击打细胞，5ns后，a激光器9用440nm的脉冲激光激发电压敏感染料10ms；

s5、在激发电压敏感染料之后，高速相机14和c二向色镜13组成的图像获取装置采集图像；每次采集图像前先进行步骤s4，每次采集图像的时间延时为激发电压敏感染料后5tns，t为自然数，随着采集次数的递增，t每次递增1次；

s6、获取细胞荧光图像之后，通过dsp处理系统15计算和绘制细胞跨膜电位的变化趋势。

所述的s6的具体计算步骤包括：

(1)、在获取的细胞荧光图像中，选取细胞边缘的像素作为荧光信号，选取原则是选取细胞边缘的三个像素的灰度值，沿着细胞边缘选取一周，并将选取的像素点进行平均得到荧光信号的平均值；

(2)、在距离细胞大于两个细胞直径的位置选取十个像素作为噪声信号，并将选取的像素点进行平均得到噪声信号的平均值；

(3)、用荧光信号的平均值减去噪声信号的平均值得到一幅图像膜电位对应的荧光信号值；

(4)、根据荧光信号强度和电位的对应关系计算每幅图像的跨膜电位值。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对于本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例的技术方案精神和范围。