双波长差分非标记显微成像的方法和装置与流程

本发明属于光学超分辨显微领域，特别涉及一种非标记的双波长差分显微成像的方法和装置。

背景技术：

光学显微技术历史悠久，是一门很古老的成像技术，它为人们观测微观世界提供了一种可行的方法，丰富了人们的视界。但是随着科学水平的不断提高，特别是生物医学和材料科学方面，对显微技术的分辨率要求越来越高，而由于阿贝衍射极限的限制，传统光学显微技术的分辨率受到极大的限制，以至于传统的光学显微技术已经不在适用，所以科学家们发明了各种超分辨显微技术。

共焦显微术除了有横向分辨率高的优点之外，它的纵向切片能力也很强。它突破了普通光学显微镜衍射极限的限制，横向分辨率是相同数值孔径的普通光学显微镜的1.4倍，纵向分辨率可以达到亚微米量级。

在共焦显微成像的基础上，zl201210331504.2提出了一种分辨率更高、成像速度更快的荧光差分显微成像技术，该技术先利用一个实心光斑扫描样品激发荧光，并同时收集该荧光信号，再利用相同波长的空心光斑扫描样品激发荧光，并同时搜集该荧光信号，再将两个荧光信号做差分处理，得到分辨率更高的样品图像。该技术虽然提高了成像的分辨率，但是因为需要扫描两次限制了成像速度，使得成像速度不够快，捕捉不到某些生理活动。

技术实现要素：

本发明提出了一种双波长差分非标记显微成像的方法和装置，使用波长接近的两束激光同时照射样品并同时探测从样品面反射的两束激光，然后将探测到的两个信号做差分处理，得到分辨率更高的图像；其中一束激光是实心光束，另一束激光是空心光束；该方法改进上述成像方法的缺陷，只需要扫描样品一次，同时也不需要用荧光染料标记样品，实现了在保持同样高分辨率的情况下，提高了成像速度。

本发明的目的是为了在提高共聚焦显微系统的横向分辨率和信噪比的同时，不降低成像速度和减少对样品的损伤。

本发明基于双波长差分非标记显微成像原理提高系统横向分辨率，使用两束波长接近的激光同时照射样品，并且同时探测从样品表面反射的两束不同波长的激光，然后对探测到的两个信号做差分处理，处理之后再进行图像的重建。

一种双波长差分非标记显微成像的方法，包括：

利用具有波长差的第一激光与第二激光扫描样品，其中有一束激光为空心光束，另一束激光为实心光束；

采集样品发出的信号光，所述的信号光包括由第一激光反射的第一信号光和由第二第一激光反射的第二信号光；

对所述第一信号光和第二信号光的数据进行相减处理，得到差分信号，并利用所述差分信号进行重建成像。

作为优选的，所述第一激光与第二激光的波长差在20-45nm。

作为优选的，以波长大于所述第一激光的第二激光为空心光束。在另一等同的方案中，也可以波长较小的第一激光作为空心光束。

进一步优选采用波长较小的第一激光作为空心光束，形成更小的空心光斑，具有更好的技术效果。

作为优选的，所述第一激光在准直后调制为p光；所述第二激光在准直后调制为p光并转换为所述的空心光束；第一激光的p光与第二激光的空心光束合束后扫描样品。

作为优选的，合束后的两束激光在转换为圆偏光后聚焦至样品面进行扫描。

采用上述的方法，本技术方案中的具体步骤如下：

(1)波长较短的第一激光器和波长较长的第二激光器发出的激光都先分别经过第一单模光纤和第二单模光纤耦合，分别再经第一准直透镜和第二准直透镜进行准直。

(2)经过准直的波长较短的激光光束，先经过第一二分之一波片，将偏振方向调制为p光，p光通过第一二色镜反射；经过准直的波长较长的激光光束，通过第一反射镜被反射，反射光透射过第二二分之一波片后经过涡旋位相板，涡旋位相板配合四分之一波片将该光调制成空心光束；经过涡旋位相板的激光束透射过二色镜后和波长较短的激光重合；重合的两束激光的方位角被第一二维扫描振镜随时间有序的改变，进而在样品面扫描样品；之后经过第一扫描透镜聚焦，同时校准由于二维扫描振镜产生的桶形畸变和枕形畸变；镜筒透镜和扫描透镜组成4f系统，用于对激光进行中继；经过镜筒透镜的激光束被第二反射镜反射到四分之一波片上，四分之一波片将激光束变成圆偏光；圆偏光被物镜聚焦样品面上；样品面的反射光和散射光沿原光路依次经过物镜和四分之一波片，变成s光；s光再依次经过第二反射镜、经镜筒透镜和扫描透镜，于第一偏振分束器处被反射；波长较短的反射光于第二二色镜反射，波长较长的反射光于第二二色镜透射；波长较短的反射光经第一窄带滤波器于第三透镜处耦合进第三单模光纤，第一光纤探测器探测第三单模光纤的波长较短的反射光；波长较长的透射光被第三反射镜反射，经过第二窄带滤波器于第四透镜处耦合进第四单模光纤，第二光纤探测器探测第四单模光纤的波长较长的反射光；

(3)第一光纤探测器和第二光纤探测器的数据被数据采集卡采集，送于计算机进行数据处理；

(4)计算机将第一光纤探测器和第二光纤探测器的数据归一化后，进行相减处理，得到差分信号；

(5)在样品平台上放置待测样品，为了完成对样品的二维测量，计算机通过控制二维扫描振镜有序的改变激光的方向角进而对样品进行扫描；

(6)扫描完一幅图像之后再将差分处理后的信号进行二维重建。

其中，根据需要测量的范围设置二维扫描振镜的扫描范围。

其中，将两束激光调制为p光是为了使准直激光通过第一偏振分束器时没有能量损失。

其中，注意涡旋位相板的方向要配合四分之一波片的方向保证波长较长的激光被调制为空心光束。

其中，四分之一波片的作用一是将线偏光调制为圆偏光，二是配合涡旋位相板将波长较长的激光束调制为空心光束。

其中，将线偏光调制为圆偏光进行扫描是为了使扫描光斑光强均匀。

其中，波长较短的实心激光束和波长较长的空心激光束同时聚焦于样品面上同一点，被样品面反射的波长较短的实心激光束和波长较长的空心激光束分别被第一光纤探测器和第二光纤探测器同时探测，第一光纤探测器和第二光纤探测器探测得到的电压信号同时被数据采集卡采集并转化为数字信号，两个数字信号归一化后再做差分处理。

其中，涡旋位相板又称0/2π位相板，他的作用是结合四分之一波片将爱里斑能量压缩至边缘，形成中心凹陷的光斑，即空心光斑，采用空心光斑和实心光斑同时对样品进行扫描，然后获取样品面反射的空心光斑和实心光斑，最后将两个光斑的结果进行差分运算，可以提高分辨率。

本发明的原理如下：

从激光器中出射的波长较短的激光光束和波长较长的激光束，分别经过单模光纤和准直透镜准直；波长较短的激光光束之后通过二分之一波片将其偏振方向调制为p方向，再通过第一二色镜反射；波长较长的激光束之后经过反射镜被反射，再通过二分之一波片将其偏振方向调制为p方向，p光经过涡旋位相板后被调制为空心光束，于第一二色镜透射，此时与波长较短的激光光束重合；重合的两束激光经过第一个偏振分束器被透射，之后经过二维扫描振镜扫描在样品面形成二维的扫描光斑，再经过4f系统后被第二反射镜反射，反射光经过第一四分之一波片后转化为圆偏光。

圆偏光经物镜聚焦于样品面。样品面的反射光和散射光先通过物镜收集，接着经过四分之一波片透射，由圆偏光转为s光，s光之后经第二反射镜反射，反射的s光再依次经过经镜筒透镜、扫描透镜和二维扫描振镜系统，于第一偏振分束器处反射；波长较短的反射光于第二二色镜反射，波长较长的反射光于第二二色镜透射；波长较短的透射光经第一窄带滤波器并于第三透镜耦合进第三单模光纤，第一光纤探测器探测第三单模光纤的波长较短的透射光；波长较长的透射光被第三反射镜反射，经过第二窄带滤波器于第四透镜耦合进第四单模光纤，第二光纤探测器探测第四单模光纤的波长较长的反射光；

在样品平台放置上样品，利用圆偏光对样品进行扫描。利用计算机控制二维扫描振镜来精确调节激光束投影于样品面上的位置，对样品进行二维扫描，通过两个光纤探测器分别获取反射的波长较短的实心光斑和波长较长的空心光斑，相应的响应信号为v(v1,u1)和v(v2,u2)；

电压信号被数据采集卡采集并变成数字信号送于计算机；计算机对两个数字信号进行归一化，然后做差分运算；重复上面的过程，直到扫描完一幅图像，然后使用计算机进行图像重建。

其中，转化为p光的原因是为了使准直激光透过第一偏振分束器时能量不会损失。

其中，将两束激光调制为p光是为了使准直激光通过第一偏振分束器时没有能量损失。

其中，注意涡旋位相板的方向要配合四分之一波片的方向保证波长较长的激光被调制为空心光束。

其中，四分之一波片的作用一是将线偏光调制为圆偏光，二是配合涡旋位相板将波长较长的激光束调制为空心光束。

其中，转化为圆偏光的原因是为了使扫描光斑光强均匀。

其中，根据需要测量的范围设置二维扫描振镜的扫描范围。

其中，波长较短的实心激光束和波长较长的空心激光束同时聚焦于样品面上同一点，被样品面反射的波长较短的实心激光束和波长较长的空心激光束分别被第一光纤探测器和第二光纤探测器同时探测，被第一光纤探测器和第二光纤探测器探测得到电压信号同时被数据采集卡采集并转化为数字信号，两个数字信号进行归一化处理后再做差分处理，差分处理能够有效提高显微镜系统的分辨率；两束激光同时照射样品和同时探测从样品面反射的两束激光，能够有效的提高成像速度。

其中，涡旋位相板又称0/2π位相板，他配合四分之一波片将爱里斑能量压缩至边缘，形成中心凹陷的光斑，即空心光斑，采用空心光斑和实心光斑同时对样品进行扫描，然后获取样品面的反射空心光斑和实心光斑，将两个光斑的结果归一化后进行差分运算，可以提高分辨率。

其中，差分的原理是，显微镜的实际psf等效为波长较短的实心激光束的psf减去450波长的空心激光束的psf，该psf变得更窄，从而提高显微镜系统得分辨率。

本发明还提供一种双波长差分非标记显微成像的装置，包括：

第一激光器和第二激光器，分别输出具有波长差的第一激光与第二激光；

位于所述第一激光或第二激光的光路上的调制元件，调制对应的激光为空心光束；

物镜，将第一激光和第二激光聚焦至样品台并收集从样品反射的信号光；

第一光纤探测器和第二光纤探测器，分别收集由第一激光反射的第一信号光和由第二第一激光反射的第二信号光；

和计算机，对所述第一信号光和第二信号光的数据进行相减处理，得到差分信号，并利用所述差分信号进行重建成像。

作为优选的，所述第一激光与第二激光的波长差在20-45nm，以波长大于所述第一激光的第二激光为空心光束。

在另一等同的方案中，也可以波长较小的第一激光作为空心光束。进一步优选采用波长较小的第一激光作为空心光束，形成更小的空心光斑，具有更好的技术效果。

作为优选的，所述第一激光和第二激光的光路上均设有二分之一波片，将对应激光光束的偏振方向调制为p光；第二激光光路上的调制元件为依次设置的涡旋位相板和四分之一波片，配合作用将所述的第二激光调制为空心光束。

作为优选的，调制为p光的第一激光与调制为空心光束的第二激光经第一二色镜后合束，通过光路上的二维扫描振镜对样品进行扫描。

作为优选的，由物镜收集的信号光经第二二色镜分束后分别进入第一光纤探测器和第二光纤探测器。

更具体地，本技术方案的双波长差分非标记显微成像的装置包括：

第一激光器和第二激光器，用于发出波长较短的激光束和波长较长的激光束；

第一单模光纤和第一准直透镜，用于对波长较短的激光束进行准直；

第二单模光纤和第二准直透镜，用于对波长较长的激光束进行准直；

第一二分之一波片，用于将波长较短的激光束调制为p光，使其通过偏振分束器时没有能量损失；

第一反射镜，用于对波长较长的激光束进行反射；

第二二分之一波片，用于将波长较长的激光束调制为p光，使其通过偏振分束器时没有能量损失；

第一涡旋位相板，用于对波长较长的激光束进行位相调制，形成空心光斑；

第一二色镜，用于反射波长较短的激光束和透射波长较长的激光束；

第一偏振分束器，用于对所述线偏光透射，并对物镜收集的反射光和散射光进行反射；

第一二维扫描振镜，用于对所述激光进行方位角的改变，从而进行样品面的扫描，并对从样品反射的激光进行解扫描；

第一扫描透镜，用于对经过扫描振镜的所述激光束进行校准，消除桶形畸变和枕形畸变；

第一镜筒透镜，用于对所述激光束进行扩束和准直，同时和扫描透镜形成4f系统；

第二反射镜，用于对所述激光束进行反射；

四分之一波片，用于将所述线偏光调制为圆偏光，使扫描光斑光强均匀分布；

物镜，用于对所述圆偏光进行聚焦，进而对样品进行扫描，并同时收集样品平台的反射光和散射光；

第二二色镜，用于将从样品面反射的波长较短的激光反射，同时将从样品面反射的波长较长的激光透射；

第一窄带滤波片，用于滤除多余的波长较长的激光；

第三透镜，用于将波长较短的激光耦合进第三单模光纤；

第三单模光纤，用于传导波长较短的激光，同时充当共聚焦的小孔；

第一光纤探测器，用于对波长较短的激光进行测量，获取电压信号；

第二窄带滤波片，用于滤除多余的波长较短的激光；

第四透镜，用于将波长较长的激光耦合进第三单模光纤；

第四单模光纤，用于传导波长较长的激光，同时充当共聚焦的小孔；

第二光纤探测器，用于对波长较长的激光进行测量，获取电压信号；

样品平台，用于放置样品；

数据采集卡，用于采集第一光纤探测器和第二光纤探测器的电压信号，并将其转换为数字信号送于计算机；

主控计算机，用于接收数据采集卡的电压信号并进行差分处理和样品图像重建，同时用于控制二维扫描振镜的运动，对样品进行扫描；

本发明对比已有技术具有以下创新点：

(1)采用双波长差分显微成像技术，提高了系统的横向分辨率和信噪比。

(2)两束激光同时照射样品，并且采集卡同时采集两个探测器的数据，提高了成像速度；

本发明对比已有技术具有以下优点：

(1)系统信噪比和分辨率高：两两差分相减的探测方法可抑制环境的状态差异的噪声从而提高信噪比，同时减小psf从而提高横向分辨率。

(2)成像速度快：只需要扫描一次样品就可以得到实心光斑和空心光斑的图像；

(3)装置结构简洁。

附图说明

图1为本发明双波长差分非标记显微成像的装置示意图；

图2为波长较短的实心激光束的psf；

图3为波长较长的空心激光束的psf；

图4为显微镜系统的实际psf，是由波长较短的实心激光束的psf减去波长较长的空心激光束的psf得到的；

图5为普通共聚焦显微系统拍摄的结果图；

图6为双波长差分非标记显微成像系统拍摄的结果图。

图中：波长较长的第一激光器1，第一单模光纤2，第一准直透镜3，第一反射镜4，第二二分之一波片5，第一涡旋位相板6，第一二色镜7，波长较短的第一激光器8，第二单模光纤9，第二准直透镜10，第一二分之一波片11，偏振分束器12，二维扫描振镜系统13，扫描透镜14，镜筒透镜15，第二反射镜16，四分之一波片17，物镜18，样品台19，第二二色镜20，第一窄带滤波片21，第三透镜22，第三单模光纤23，第一光纤探测器24，第三反射镜25，第二窄带滤波片26，第四透镜27，第四单模光纤28，第二光纤探测器29，数据采集卡和计算机30，显示屏31。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

一种双波长差分非标记显微成像的装置，如图1所示，包括：波长较长的第一激光器1，第一单模光纤2，第一准直透镜3，第一反射镜4，第二二分之一波片5，第一涡旋位相板6，第一二色镜7，波长较短的第一激光器8，第二单模光纤9，第二准直透镜10，第一二分之一波片11，偏振分束器12，二维扫描振镜系统13，扫描透镜14，镜筒透镜15，第二反射镜16，四分之一波片17，物镜18，样品台19，第二二色镜20，第一窄带滤波片21，第三透镜22，第三单模光纤23，第一光纤探测器24，第三反射镜25，第二窄带滤波片26，第四透镜27，第四单模光纤28，第二光纤探测器29，数据采集卡和计算机30，显示屏31。其中，第一单模光纤2的出射端面位于第一准直透镜3的物方焦点附近，第二单模光纤9的出射端面位于第二准直透镜10的物方焦点附近；样品平台19放置在物镜18的焦平面上，第三单模光纤23放置在第三透镜22的6焦平面，第四单模光纤28放置在第四透镜27的焦平面；计算机和数据采集卡组成30，计算机和数据采集卡30与第一光纤探测器24和第二光纤探测器29相连，计算机和数据采集卡30与二维扫描振镜相连，计算机和数据采集卡30与显示屏31相连。

本实施例中，波长较长的第一激光器1输出的激光波长为445，波长较短的第一激光器8输出的激光波长为405。

采用图1所示的装置，使用双波长非标记差分显微成像提高横向分辨率的方法如下：

从第一激光器1发出的波长较长的激光光束，首先被导入单模光纤2，从单模光纤2出射的波长较长的激光光束，经过准直透镜3完成初级准直；经过初级准直的波长较长的激光光束再通过第一反射镜4被反射，波长较长的激光束的角度偏转90度；经过角度偏转的波长较长的激光束经过第二二分之一波片5被调制位p光；p光再经过涡旋位相板6进行位相调制，变成空心光束；空心光束经过第一二色镜7透射，与波长较短的激光束重合。从第一激光器8发出的波长较短的激光光束，首先被导入单模光纤9，从单模光纤9出射的波长较短的激光光束，经过准直透镜10完成初级准直；经过初级准直的波长较短的激光光束再通过第一二分之一波片被调制为p光；p光之后于第一二色镜7被反射，与波长较长的激光光束重合。

重合的两束激光束之后透射过第一偏振分束器12，其中第一二分之一波片和第二二分之一波片的目的是保证两束激光的偏振方向与第一偏振分束器12允许透射的偏振方向相同，这样可以使激光光束在透过第一偏振分束器12时不会被反射而产生大量的能量损失。

p光透射过第一偏振分束器12之后，接着经过二维扫描振镜13，二维扫描振镜的运动轨迹是由计算机30控制，扫描方式是光栅式扫描，目的是使激光束在样品面也是光栅式的扫描样品，从而得到视场较大的样品图像。

被二维扫描振镜改变方向角的激光束通过一个扫描透镜14和镜筒透镜15组成的4f系统，其中扫描透镜14的作用是校准由于二维扫描振镜产生的桶形畸变和枕形畸变，镜筒透镜15是为了中继和准直激光光束。

经过4f系统的激光光束接着被第二反射镜16反射到达四分之一波片17，四分之一波片17的作用一是将p光调制为圆偏光，使扫描样品的光斑更均匀，二是配合涡旋位相板6将波长较长的激光束调制位空心光束。圆偏光再经过物镜18被聚焦在样品面上。

样品面的反射光和散射光由物镜18的收集，透射过四分之一波片17变成s光，并于第二反射镜16处反射，再经过4f系统后被二位扫描振镜解扫描，其中，解扫描是为了使反射光和散射光在入射到第三透镜22和第四透镜27时是水平入射，保证激光束经过第三透镜22和第四透镜27聚焦后，在其后焦面处是不动点。

经过解扫描的反射光和散射光于第一偏振分束器12后被反射；反射光经过第二二色镜20时，波长较短的激光束被反射，波长较长的激光束被透射，从而分开两束激光。

被反射的波长较短的激光束经过第一窄带滤波器21，滤除多余的波长较长的激光束，其中第一窄带滤波器21的中心波长是波长较短的激光的中心波长；经过滤光片的波长较短的激光束再经过第三透镜聚22聚焦于后焦面上，进而耦合进第三单模光纤23，其中第三单模光纤23的端面位于第三透镜聚22的焦点上；第三单模光纤23将激光束送于第一探测器24进行探测，输出电压信号。

被透射的波长较长的激光束经过第三反射镜25被反射，反射光再经过第二窄带滤波器26，滤除多余的波长较短的激光束，其中第二窄带滤波器26的中心波长是波长较长的激光束的中心波长；经过滤光片之后的波长较长的激光束再经过第四透镜聚27聚焦于后焦面上，从而耦合进第四单模光纤28，其中第四单模光纤28的端面位于第四透镜聚27的焦点上；第四单模光纤28将激光束送于第二探测器29进行探测，输出电压信号。

输出的两个电压信号被数据采集卡30采集，之后传给计算机30进行处理，其中，先由计算机控制二维扫描振镜13运动进而使激光对样品进行光栅式扫描，扫描的同时，采集卡的两个通道分别同时采集第一探测器24和第一探测器29的电压信号，采集完一幅图像的数据之后，两个通道的数据先进行归一化，接着进行差分处理，差分后的数据进行重排列，形成一个二维数组，将二维数组经过数据处理之后再显示在显示屏31上。

由于将波长较短的实心激光束和波长较长的空心激光束进行了差分处理，在提高分辨率的同时也提升了信噪比(可抑制环境的状态差异的噪声)，同时成像速度也较快(相比于用实心光斑扫描完一幅图像之后，再用空心光斑扫描来说速度提升了一倍)。

图2到图4显示了双色差分共聚焦的原理，波长较短的实心光束的psf减去波长较长的空心光束，得到一个更小的实心光束，该实心光束等效为该显微镜的实际psf，更小的psf意味着更好的分辨率。

图5到图6表明使用双波长差分非标记显微成像的方法和装置后，成像分辨率得到了提升。图5是普通共聚焦显微系统拍摄的荧光微球的结果图，图6是双波长差分非标记显微成像系统拍摄的结果图，其中拍摄的是样品的同一区域。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。